I microRNA (miR) sono piccoli frammenti di RNA non codificante a singolo filamento, lunghi circa 20-30 nucleotidi, in grado di agire a livello post-trascrizionale nella modulazione dell'espressione genica, inibendo la traduzione o promuovendo la degradazione dell'mRNA bersaglio. In quanto regolatori dell'espressione genica a livello post-trascrizionale, i miR svolgono un ruolo essenziale in un gran numero di processi fisiologici e patologici. Alterazioni dei livelli di espressione intracellulari di diveri miR sono state descritte in numerose patologie.
In particolare, il miR-155 è un riconosciuto marker in diversi linfomi a cellule B e recenti lavori sperimentali hanno associato la sua regolazione positiva a un incremento della risposta infiammatoria e a un aumentata incidenza di alcuni tumori solidi. La sua regolazione negativa pare invece essere implicata in deficit della risposta immunitaria, sia a livello di cellule della memoria che nella produzione anticorpale.
Questo studio si è prefisso di analizzare l’espressione del miR-155 in tre condizioni:
- A) l’espressione basale del miR-155 nelle PBMC (peripheral blood mononuclear cells) di pazienti cronicamente in emodialisi, processando direttamente le cellule prelevate da sangue periferico
- B) l’espressione del miR-155 nelle PBMC durante il contatto del sangue con membrane dialitiche di polisulfone a bassa permeabilità (al termine del periodo interdialitico lungo), prima e dopo seduta emodialitica di 4 ore
- C) l’espressione del miR-155 nelle PBMC di pazienti cronicamente in emodialisi dopo 24 ore in apposito terreno di coltura e stimolando parte di esse.
Il miR-155 è stato isolato da PBMC di 9 pazienti in emodialisi (età compresa tra 50 e 75 anni, 1 donna e 8 uomini; P=NS) e confrontato con 7 individui sani (gruppo di controllo, età compresa tra i 30 e i 50 anni, 3 donne e 4 uomini; P=NS).
Il miR-155 è stato isolato da PBMC di 9 pazienti in emodialisi (età compresa tra 50 e 75 anni, 1 donna e 8 uomini; P=NS) prima e dopo seduta emodialitica di 4 ore con membrane di polisulfone a bassa permeabilità, al termine del periodo interdialitico lungo.
Il miR-155 è stato isolato da PBMC di 6 pazienti in emodialisi (per ciascun paziente sono stati analizzati due campioni differenti per verificare l’assenza di differenze intrapaziente; 3 uomini e 3 donne, età compresa tra i 50 e i 75 anni; P=NS).
Le cellule sono state mantenute 24 ore in terreno di coltura composto da RPMI (Roswell Park Memorial Institute, CA), FBS (siero fetale bovino) 10% e antibiotico (penicillina/streptomicina) 1% stimolando metà di ciascun campione durante l'incubazione con PHA (fitoemagglutinina), lectina mitogena di origine vegetale nota per la capacità in vitro di indurre proliferazione dei linfociti T, stimolandone le mitosi e la trasformazione in grandi cellule blastiche analoghe agli immunoblasti.
I livelli di espressione del miR-155 sono stati quantificati mediante Real-Time PCR utilizzando il kit TaqMan microRNA real-time RT-PCR kit (Applied Biosystems, CA). Le reazioni di PCR sono state condotte in duplicato utilizzando apposito termociclatore. I valori di "cycle thershold" (Ct) sono stati calcolati utilizzando il software di analisi quantitativa per PCR, SDS versione 2.3 (Applied Biosystems, CA). I dati sono espressi in media ± errore standard; le significatività statistiche sono state calcolate mediante t-test.
Tutti i pazienti non presentavano malattie neoplastiche, ematologiche o infiammatorie.
A): nei pazienti, la relative quantity (RQ) del miR-155 pre-dialisi, proveniente da PBMC direttamente processate dopo il prelievo da sangue periferico, al termine del periodo interdialitico lungo, era 3,77± 0,62 volte maggiore rispetto al gruppo controlli (P=0,003) (Fig. 1).
B): non sono state riscontrate differenze di RQ tra inizio e termine della seduta emodialitica: RQ dei pazienti nel post-dialisi vs controlli 3,49 ± 0,70 (P=NS vs. pre-HD) (Fig. 2).
C): l'RQ del miR-155 pre-dialisi nelle PBMC poste in terreno di coltura e stimolate con PHA era 1,79 ± 0,59 volte maggiore rispetto alle cellule coltivate ma non stimolate (P=0,019) (Fig. 3).
Questi dati preliminari su PBMC di pazienti emodializzati mostrano una significativa regolazione positiva del miR-155 confrontato con un gruppo di controlli sani. Tale riscontro appare coerente con il ruolo pro-infiammatorio in cui la dialisi è implicata. Tuttavia, l'assenza di differenze statisticamente significative tra pre e post-dialisi, induce a supporre che tale stato infiammatorio, pur cronico, non venga esacerbato dalla singola seduta. L’ulteriore regolazione positiva riscontrata nelle cellule coltivate con l’aggiunta di stimolante rispetto a quelle in coltura semplice, evidenzia come i livelli di miR-155 possano venire utilizzati come indicatore di proliferazione delle cellule del sistema immunitario.
La prosecuzione dello studio si prefiggerà di chiarire ulteriormente le variazioni d'espressione del miR-155 non solo nell’emodialisi ma anche nell’insufficienza renale in stadi pre-dialitici e anche in altri processi patologici come nell'immunosoppressione conseguente al trapianto d'organo e le malattie cardiovascolari nei nefropatici.
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