Il dosaggio del p-Cresolo Solfato (pCS) nei campioni biologici può rappresentare un valore predittivo per determinare complicazioni cardiovascolari che possono insorgere durante il trattamento emodialitico (R. Vanholder 1999 [1] (full text) , B.K. Meijers, 2008 [2]). L’obiettivo di questo studio è di valutare l’utilizzabilità della tecnica Multiple Reaction Monitoring (MRM) al fine di migliorare la sensibilità e la selettività della identificazione del pCS in piccole quantità di plasma dei pazienti uremici (N.R. Kitteringham, 2009 [3]).
A trenta µL di plasma di pazienti uremici è stato aggiunto uno standard interno (IS) per valutare eventuali perdite di pCS durante la preparazione e l’analisi del campione. Dopo la deproteinizzazione con Metanolo (1:4 v/v), il supernatante è stato concentrato e risospeso nella fase mobile dell’ HPLC. Un µL di campione deproteinizzato è stato quantificato usando un HPLC accoppiato alla spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) su triplo-quadrupolo (Figura A).
Un dosaggio di pCS altamente sensibile e selettivo è stato ottenuto attraverso la selezione specifica dello ione parentale (m/z 187) e monitorando I due frammenti ionici figli (m/z 80.00 e 107.00). Sono state applicate diverse curve di calibrazione: la calibrazione esterna (EC) è stata effettuata usando soluzioni standard di pCS, la calibrazione con le aggiunte standard (AC), ottenuta aggiungendo diverse concentrazioni di pCS standard nel campione e la calibrazione Youden (YC) realizzata incrementando il volume del campione.
Un picco ben risolto per il pCS è stato ottenuto 2 min dopo l’iniezione del campione. L’analisi è stata effettuata usando la tecnica MRM monitorando le seguenti transizioni: m/z 187 → 80.00 e m/z 187 → 107.00 per il pCS (Figura B). Tutte le curve di calibrazione hanno mostrato un eccellente linearità. Il confronto tra la pendenza e l’intercetta per i diversi tipi di calibrazioni hanno indicato la presenza di un effetto matrice. La curva di calibrazione empirica denominata Matrix-Corrected Calibration (MCC) è ottenuta dai parametri di regressione delle curve YC- e AC- ed è stata utilizzata per correggere l’effetto della matrice sulla quantificazione del pCS (L. Cuadros-Rodriguez, 2007 [4]).
Il metodo di analisi mostra una buona precisione nella stessa giornata, compresa tra 0.21 e 4.57%, ed un ottima ripetibilità, valutata in diverse giornate, compresa tra 1.63 e 6.67%. La percentuale di recovery ottenuta per soluzioni a diverse concentrazioni di pCS è compresa tra 100% e 107%, indicando un ottima accuratezza e selettività del test.
L’approccio MRM si è rivelato altamente sensibile e selettivo, esso mostra inoltre un’eccellente ripetibilità. Il metodo sviluppato richiede un ridotto volume di campione, un tempo di analisi molto breve e una metodica di preparazione semplice (Cuoghi A. 2012 [5]).
Lo sviluppo di un metodo sensibile e accurato per la quantificazione del pCS nel plasma è molto importante in medicina clinica per predire l’insorgenza di complicazioni cardiovascolari nel pazienti emodialitici.
[1] Vanholder R, De Smet R, Lesaffer G et al. p-cresol: a toxin revealing many neglected but relevant aspects of uraemic toxicity. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association - European Renal Association 1999 Dec;14(12):2813-5 (full text)
[2] Meijers BK, Bammens B, Verbeke K et al. A review of albumin binding in CKD. American journal of kidney diseases : the official journal of the National Kidney Foundation 2008 May;51(5):839-50
[3] Kitteringham NR, Jenkins RE, Lane CS et al. Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics. Journal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences 2009 May 1;877(13):1229-39
[4] Cuadros-Rodríguez L, Bagur-González MG, Sánchez-Viñas M et al. Principles of analytical calibration/quantification for the separation sciences. Journal of chromatography. A 2007 Jul 27;1158(1-2):33-46
[5] Cuoghi A, Caiazzo M, Bellei E et al. Quantification of p-cresol sulphate in human plasma by selected reaction monitoring. Analytical and bioanalytical chemistry 2012 Aug 7;
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