INTRODUZIONE

L’emodialisi (ED) induce uno stato di infiammazione cronica ed un aumento dello stress ossidativo (SO), fattori di rischio emergenti per la patologia cardiovascolare (Morena M - 2005). [1] La Pentraxina 3 (PTX3) è il capostipite delle pentrassine lunghe ed è prodotta dalle cellule endoteliali, monociti-macrofagi, cellule dendritiche e granulociti neutrofili in risposta a stimoli proinfiammatori  (Deban L - 2011). [2] L’aumento dei livelli plasmatici della PTX3 si associa a un’aumentata mortalità cardiovascolare nei pazienti (pz) con malattia renale cronica(Tong M - 2007). [3] (full text)Scopo del nostro studio è stato quello di valutare in vivo la produzione NADPH-dipendente di ROS da parte di neutrofili circolanti nei pz in ED ed il loro possibile ruolo nella produzione della PTX3.  

PAZIENTI E METODI

• Sono stati arruolati 48 pz in ED trisettimanale trattati con membrane sintetiche (età media 62,6 aa; età dialitica media 33,9 mesi) e 10 soggetti sani (C).
• L’attivazione dei neutrofili è stata valutata misurando l’espressione della L-selectina mediante citofluorimetria.
• L’espressione proteica della PTX3 è stata analizzata con citofluorimetria e microscopia confocale.
• La concentrazione plasmatica di PTX3 è stata misurata usando per il dosaggio ELISA un kit disponibile in commercio (Human Pentraxin3/TSG-14 Immunoassay R&D Systems).
• La produzione intracellulare di ROS è stata valutata mediante fluorescenza con la 2',7'-Diclorodiidrofluoresceina.
• L’attività della NADPH ossidasi à stata determinata mediante un saggio di chemiluminescenza.

RISULTATI

L’analisi citofluorimetrica dei neutrofili (CD16b+, CD18+) mostrava un incremento significativo dell’espressione della L-selectina (CD62L) a 240’ (T240) di ED, rispetto all’inizio della seduta (T0) (p=0,01), a conferma della loro attivazione associata all’aumentata capacità di adesione cellulare all’endotelio vascolare (Figura 1).

L’attivazione dei neutrofili si associava ad un aumento significativo dell’espressione proteica della PTX3 (T30 vs T0,p=0,0003;T240 vs T0,p<0,00001) (Figura 2).

La PTX3 colocalizzava conla Collagenasi IVall’interno dei granuli secondari citoplasmatici (Figura3) ed il suo rilascio da parte dei neutrofili si associava ad un aumento significativo dei suoi livelli plasmatici, più evidente al T240(p=0,005 vs T0) (Figura 4).

I livelli di ROS intracellulari misurati nei neutrofili mediante analisi citofluorimetrica erano significativamente aumentati dopo T240di ED (74,1±14,0 % cellule positive) rispetto al T0(29,6±15,5 % cellule positive; p=0,009), indicando un aumento dello SO (Figura 5A). Inoltre, la produzione di superossido NADPH-dipendente era significativamente aumentata a T240(553,2±83,3 RLU/min*0,015mg)rispetto al T0(245,0±54,1 RLU/min*0,015mg; p=0,01) (Figura 5B).

CONCLUSIONI

I risultati del nostro studio dimostrano che in ED è presente uno stato di attivazione dei neutrofili associato ad un aumento dell’espressione di PTX3 e della produzione NADPH-dipendente di ROS. La comprensione dei meccanismi coinvolti nell’incremento della produzione di PTX3 e dell’aumentato SO associato all’infiammazione cronica in ED potrebbe fornire nuovi target terapeutici atti a prevenire o rallentare la progressione della malattia cardiovascolare.