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Genetica e omiche / Modelli sperimentali / Trasduzione del segnale

SILENZIAMENTO GENICO DI GDNF IN CELLULE HK-2 E SUO POSSIBILE COINVOLGIMENTO NEL PROCESSO DELLA NEFROCALCINOSI

Questo Abstract è stato accettato come Poster.

Abstract

Introduzione. MSK è una condizione malformativa renale con un alto rischio di nefrocalcinosi e difetti tubulari funzionali. Recentemente abbiamo scoperto varianti rare di GDNF associati ad MSK in un sottogruppo di pazienti con nefrolitiasi, nefrocalcinosi e MSK bilaterale. L’asportazione di un carcinoma renale in un paziente con MSK e mutazione di GDNF IVS218G>A ci ha permesso di studiare il significato funzionale della mutazione GDNF e di verificare che colture di cellule papillari renali, in cui l’ espressione di GDNF era down-regolata, differenziavano spontaneamente verso la linea osteogenica, sintetizzando proteine tipiche dell’osso. Per appurare la possibile relazione tra la down-regolazione di GDNF ed il fenomeno osteogenetico osservato, è stato condotto uno studio di silenziamento di GDNF in cellule tubulari renali HK-2.

Materiali e Metodi. Per un silenziamento stabile di GDNF, sono stati utilizzati 5 shRNA antisenso al gene umano GDNF. Come controllo (-), abbiamo utilizzato un plasmide senza shRNA. I cloni transfettati sono stati coltivati in terreno DMEM F12 10% FBS. L’espressione di GDNF è stata quantificata mediante Real Time RT/PCR e l’avvenuto silenziamento confermato anche a livello proteico mediante anticorpo anti GDNF. I cloni silenziati per GDNF, il controllo (-) e cellule wt sono state coltivate per 15gg in terreni di stimolazione osteogenica. L’analisi SEM e la colorazione von Kossa sono stati utilizzati per analizzare la deposizione di Ca2PO4.

Risultati e Conclusioni. I nostri risultati hanno dimostrato in HK-2 silenziate e in condizioni di stimolazione osteogenica la presenza dei depositi di Ca2PO4 confermati dal von Kossa e dal SEM. I depositi di Ca2PO4 non sono stati osservati nei cloni silenziati, nel controllo (-) e nei wt in condizioni normali, mentre nel controllo (-) in condizioni di stimolazione osteogenica la deposizione di Ca2PO4 era presente in quantità significativamente inferiore a quella del clone silenziato. La down-regolazione di GDNF in HK-2 favorirebbe la deposizione di Ca2PO4 tramite un meccanismo non ancora identificato. La nostra ipotesi è che l'apoptosi potrebbe essere la chiave.

R. Cristofaro(1), V. Masola(2), M. Ceol(1), G. Priante(1), A. D'Angelo(1), F. Anglani(1)
((1)1laboratorio Di Istomorfologia E Biologia Molecole Del Rene, Divisione Di Nefrologia, Dipartimento Di Medicina Padova , (2)2dipartimento Di Scienze Sperimentali Biomediche, Università Di Padova , (3)1laboratorio Di Istomorfologia E Biologia Molecole Del Rene, Divisione Di Nefrologia, Dipartimento Di Medicina Padova , (4)1laboratorio Di Istomorfologia E Biologia Molecole Del Rene, Divisione Di Nefrologia, Dipartimento Di Medicina Padova , (5)1laboratorio Di Istomorfologia E Biologia Molecole Del Rene, Divisione Di Nefrologia, Dipartimento Di Medicina Padova , (6)1laboratorio Di Istomorfologia E Biologia Molecole Del Rene, Divisione Di Nefrologia, Dipartimento Di Medicina Padova )
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