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Genetica e omiche / Modelli sperimentali / Trasduzione del segnale

DISREGOLAZIONE DELLA BIOSINTESI E DEL METABOLISMO DEI PROTEOGLICANI/GLICOSAMINOGLICANI NEI SOGGETTI UREMICI: UNO STUDIO DI GENOMICA FUNZIONALE

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INTRODUZIONE

Negli ultimi anni l’incidenza della malattia renale cronica (MRC) è notevolmente aumentata e, nonostante il trattamento poli-farmacologico abbia rallentato la sua progressione verso l’insufficienza renale terminale (uremia), al momento non è possibile arrestare totalmente questo fenomeno. Inoltre, nei pazienti con MRC,  lo stato di microinfiammazione cronica e le notevoli alterazioni del profilo biochimico-metabolico, determinano una  maggiore incidenza di mortalità per patologie cardiovascolari [Matsushita K and 2010 [1], Go AS and 2004 [2] (full text)]. In questo contesto, la disfunzione endoteliale sistemica, gioca un ruolo fondamentale.

Tra i vari fattori potenzialmente responsabili del processo di induzione e mantenimento del danno vascolare nei soggetti con MRC, le alterazioni del glicocalice sembrano avere un ruolo di primo piano [Salmon AH and 2012 [3]]. Il glicocalice è formato da glicosaminoglicani (GAG) quali eparan solfato (HS) e acido ialuronico, proteoglicani (PG) (per esempio sindecano-1), e una serie di proteine plasmatiche Weinbaum S and 2007 [4],Van Teeffelen JW and 2007 [5]]. Tale struttura è coinvolta nel mantenimento della tonicità vascolare e nella regolazione della permeabilità vascolare [Kumagai R and 2009 [6]]. Allo stato attuale, solo alcuni report hanno descritto il ruolo del glicocalice nello sviluppo delle comorbidità in pazienti diabetici [Broekhuizen LN and 2010 [7]] e uremici sottoposti al trattamento sostitutivo dialitico [Flessner MF and 2008 [8] (full text)]. L’analisi sistematica del ruolo di questo importante elemento nei soggetti con MRC  potrebbe aprire la strada allo sviluppo di nuovi biomarker di progressione e target di intervento farmacologico.

SCOPO DELLO STUDIO

Per definire il coinvolgimento dei proteoglicani/glicosaminoglicani nella progressione del danno renale cronico e nella genesi delle comorbidità associate, abbiamo utilizzato un approccio combinato tra tecnologia di screening genomico (microarray su RNA estratto da linfomonociti periferici) e biologia molecolare classica.

MATERIALI E METODI

Pazienti. Nel nostro studio sono stati inclusi 105 pazienti suddivisi, successivamente, in un  training-group [n=17 emodializzati (ED), n=10 peritoneo-dializzati (DP), n=9 pazienti con insufficienza renale cronica II-III stadio K/DOQI (IRC II-III) e n=5 soggetti normali (NORM)] e un testing-group (n=18 ED, n=17 DP, n=11 IRC IV-V, n=7 IRC II-III e n=11 NORM). Per tutti i pazienti inseriti nel testing-group sono stati misurati i livelli di proteina C reattiva (PCR) mediante una metodica immunonefelometrica ad alta sensibilità seguendo il protocollo della ditta produttrice.  

Isolamento dei linfomonociti del sangue periferico (LMP). Per tutti i pazienti inseriti nello studio sono stati isolati i LMP mediante stratificazione su gradiente di Ficoll-Paque (460 g per 30 min), lavati 3 volte con PBS pH 7.4/1 mM EDTA. Le cellule sono state successivamente contate e la loro vitalità è stata valutata mediante il metodo di esclusione trypan blue (vitalità >90%)

Estrazione dell’RNA e profilo di espressione genica. L’RNA totale estratto dai LMP isolati dai pazienti inseriti nel training-group è stato ibridato alla piattaforma microarray HG-U133A (Affymetrix) seguendo le istruzioni della ditta produttrice.

Mediante tre algoritmi statistici (ANOVA, Kruskal-Wallis test e distinction calculation) e la stima del false discovery rate (FDR) abbiamo misurato le variazioni trascrittomiche relative a 210 geni codificanti per proteine coinvolte nella biosintesi e nel metabolismo di proteoglicani/glicosaminoglicani. L’analisi statistica e bioinformatica è stata effettuata con i software r-progect e Gene-Set Enrichment Analysis.

Colture cellulari. Cellule endoteliali microvascolari umane (HMVEC) (Clonetics) sono state tenute in medium di crescita EGM-2MV e stimolate con LPS (Sigma) 1µg/ml  per 6 ore. Successivamente è stato estratto l’RNA ed è stata effettuata l’analisi di espressione genica.

I LPM isolati da 3 soggetti normali sono stati tenuti in medium RPMI-1640 (Sigma) e stimolati con LPS 10 µg/ml  per 4 ore. Successivamente è stato estratto l’RNA ed è stata effettuata l’analisi di espressione genica.

Real-Time PCR. Un µg di RNA è stato retrotrascritto in cDNA usando il kit SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) seguendo le istruzioni della ditta produttrice. Le reazioni di PCR sono state condotte su ABI-Prism 7500 usando Power SYBR Green Master Mix 2X (Applied Biosystems). L’espressione genica di HPSE (eparanase) è stata valutata mediante metodo Ct comparativo (ΔΔCt) normalizzata rispetto al GAPDH.

Saggio di attività di HPSE. L’attività dell’enzima HPSE è stata valutata su campioni di plasma ottenuti dai pazienti inseriti nel testing-group. Il saggio misura la capacità dell’enzima di degradare i proteoglicani eparan-solfato presenti nel Matrigel (MatrigelTM Basement Membrane Matrix). Venticinque µl di Matrigel sono stati utilizzati per coattare una piastra da 96 pozzetti e successivamente sono stati aggiunti i campioni di plasma e incubati overnight a 37°C. Dopo incubazione con anticorpo primario (specifico per l’HPSE) e secondario (coniugato con perossidasi) è stata letta l’assorbanza a 405 nm. L’attività dell’HPSE è stata calcolata come differenza del valore di assorbanza a 405 nm con e senza eparina, usata per garantire la specificità del dosaggio. L’attività plasmatica di eparanase e i livelli circolanti di VEGF sono stati correlati con i valori di PCR.

Livelli plasmatici di VEGF. I livelli plasmatici del Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) sono stati misurati in tutti i pazienti inclusi nel testing-group mediante un saggio ELISA (OmniKine) disponibile commercialmente e seguendo le istruzioni della ditta produttrice.

RISULTATI

Profilo trascrittomico dei geni coinvolti nel metabolismo di GAG /PG in LMP

Il profilo trascrittomico di 94 gene probe set (67 geni) coinvolti nel metabolismo dei GAG/PG era in grado di differenziare i pazienti in DP ed ED da quelli con IRC II-III e dai NORM  (p<0,001, FDR <5%) (Figura 1 e 2). NORM e IRC II-III presentano un pattern di espressione genica simile (p<0,54). Inoltre, 34 geni risultavano iper-espressi e 33 sotto-espressi nei pazienti in DP/ED rispetto ai NORM/IRC II-III. In particolare, per la validazione biologica abbiamo focalizzato la nostra attenzione su due geni (HPSE e VEGF) la cui espressione era significativamente elevata nei soggetti uremici.

Livelli plasmatici di HPSE e VEGF.

L’attività enzimatica dell’eparanase, valutata mediante ELISA, risultava significativamente aumentata nei DP, ED e IRC IV-V rispetto ai pazienti con IRC II-III e ai NORM (p<0.001). Non vi era una differenza significativa tra i livelli riscontrati nei pazienti con IRC II-III e soggetti NORM.  (Figure 3).

Lo stesso andamento si riscontrava dopo valutazione dei livelli plasmatici di VEGF (Figura 4).

Correlazione tra livelli plasmatici di HPSE/VEGF e infiammazione cronica.

Dal nostro studio è emerso che esiste una correlazione lineare fra l’attività plasmatica dell’HPSE  e livelli di proteina-C-reattiva (PCR) (p<0.001, R2=0.11) (Figura 5A). Non è stata rilevata una correlazione statisticamente significativa fra i livelli di VEGF e la PCR (Figura 5B). 

Stimolazione con LPS

L’espressione del gene dell’HPSE in LMP di soggetti normali stimolati con LPS 10 µg/ml per 4 ore aumenta significativamente rispetto al controllo (p=0.04). Analogamente, la stimolazione delle HMVEC con LPS 1 µg/ml per 6 ore determina un incremento significativo dell’espressione dell’HPSE rispetto al controllo (p=0.015) (Figura 6).

CONCLUSIONI

Nel nostro studio è stata analizzata, per la prima volta, la via metabolica dei GAG/PG in pazienti con danno renale cronico. L’approccio combinato tra una metodologia high-troughput e tecniche classiche di biologia molecolare ha permesso di individuare un pattern trascrittomico caratteristico dell’uremia terminale. Inoltre, è emerso il potenziale ruolo chiave dell’eparanase e del vascular endothelial growth factor nella regolazione della complessa macchina biologica che, in associazione alla microinfiammazione cronica, è coinvolta nella progressione del danno renale e nella genesi delle alterazioni vascolari responsabili dello sviluppo delle complicanze cardio-vascolari in questa estesa popolazione di pazienti.

BibliografiaReferences

[1] Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, Matsushita K, van der Velde M et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet 2010 Jun 12;375(9731):2073-81

[2] Go AS, Chertow GM, Fan D et al. Chronic kidney disease and the risks of death, cardiovascular events, and hospitalization. The New England journal of medicine 2004 Sep 23;351(13):1296-305 (full text)

[3] Salmon AH, Ferguson JK, Burford JL et al. Loss of the endothelial glycocalyx links albuminuria and vascular dysfunction. Journal of the American Society of Nephrology : JASN 2012 Aug;23(8):1339-50

[4] Weinbaum S, Tarbell JM, Damiano ER et al. The structure and function of the endothelial glycocalyx layer. Annual review of biomedical engineering 2007;9:121-67

[5] Van Teeffelen JW, Brands J, Stroes ES et al. Endothelial glycocalyx: sweet shield of blood vessels. Trends in cardiovascular medicine 2007 Apr;17(3):101-5

[6] Kumagai R, Lu X, Kassab GS et al. Role of glycocalyx in flow-induced production of nitric oxide and reactive oxygen species. Free radical biology & medicine 2009 Sep 1;47(5):600-7

[7] Broekhuizen LN, Lemkes BA, Mooij HL et al. Effect of sulodexide on endothelial glycocalyx and vascular permeability in patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia 2010 Dec;53(12):2646-55

[8] Flessner MF Endothelial glycocalyx and the peritoneal barrier. Peritoneal dialysis international : journal of the International Society for Peritoneal Dialysis 2008 Jan-Feb;28(1):6-12 (full text)

release  1
pubblicata il  28 settembre 2012 
da V. Masola, G. Zaza, M. Proglio, S. Granata, G. Gambaro, C. Rugiu, A. Lupo
(Sezione di Nefrologia, Università di Verona)
Parole chiave: disfunzione endoteliale, Glicosaminoglicani/Proteoglicani, Heparanase, infiammazione cronica, insufficienza renale cronica, rischio cardiovascolare, Trascrittomica, VEGF
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