INTRODUZIONE

Attualmente lʹutilizzo di modelli animali nel campo della ricerca nefrologica é considerato fondamentale per studiare la patogenesi e per testare lʹefficacia di possibili trattamenti atti a prevenire o curare patologie renali. I principali metodi utilizzati per la misurazione della funzione renale sono la quantificazione della blood urine nitrogen (BUN) e della creatinina (Crea) a livello sierico.

Questi metodi analitici hanno mostrato alcune controindicazioni:

• lʹutilizzo della Crea come marcatore di danno si é rivelato fallace nel momento in cui si é utilizzato un modello di danno renale acuto (AKI) indotto da rabdiomiolisi
• il continuo campionamento sanguinio comporta allʹanimale un reiterato stress
• lʹutilizzo di anestetici comporta variazioni nella funzionalitá renale
• la misurazione del tasso di filtrazione renale (GFR) costituisce la tecnica migliore per la valutazione della funzionalitá renale.

In questo studio é stato utilizzato un innovativo strumento di misurazione transcutanea del GFR sviluppato dal Prof. Gretz e colleghi dellʹUniversitá di Heidelberg (Germania)( Schreiber A. et al, 2012 [1]). Esso permette la misurazione della cinetica della Sinistrina FITC, in particolare del suo tempo di dimezzamento (T1/2), che puó essere convertito in GFR attraverso la formula in Figura 1.

Lo scopo del lavoro è l’applicazione di questo metodo per la valutazione del GFR in topi SCID con AKI da glicerolo, modello della sindrome di Crush.

MATERIALI & METODI

• Strumento di misurazione transcutanea del GFR: lo strumento è composto da due LED per lʹemissione a 470nm per lʹeccitazione del FITC e di un fotodiodo per la misurazione della fluorescenza con sensibilitá massima a 525nm. In seguito allʹamplificazione e alla digitalizzazione, i dati vengono accumulati in una memoria interna. In seguito alla misurazione essi sono scaricabili sul computer attraverso un cavo USB (Figura 2).

• Sinistrina-FITC: previa misurazione del GFR, viene inoculato endovena la Sinistrina (molecola esogena esclusivamente escreta a livello renale) associata al cromoforo FITC (picchi eccitazione/emission: 490/525 nm) che emette la fluorescenza captata dello strumento.
• Modello animale: sono stati utilizzati topi SCID (Charles River) in cui é stata inoculata una dose pari a 8ml/peso corporeo (kg) di glicerolo al 50% (Sigma-Aldrich). La conseguente rabdomiolisi comporta lʹaccumulo di aggregati proteici a livello glomerulare e il successive danno tissutale.
• Misurazione della GFR: le misurazioni sono state effettuate a determinati intervalli: il GFR basale, prima del danno (considerato il giorno 0) e a 18h, 48h, 72h, giorno 5, giorno 10 e giorno 30 dopo il danno (Figura 0). Sotto effetto di una breve anestesia da isofluorano, lʹanimale viene depilato. Grazie ad un cerotto biadesivo (Lohmann GmbH & Co. KG, Neuwied), lo strumento viene fissato sul dorso dellʹanimale. Inizialmente viene misurato il rumore di fondo (per 1 min) e in seguito viene inoculata endovena (intraoculare) la Sinistrina-FITC (15mg/100g peso corporeo). La misurazione dura 1h.
• Misurazione BUN e Crea e analisi istologica: contemporaneamente allʹanalisi del GFR, sono stati valutati i valori sierici di BUN e Crea e inoltre é stata effettuata lʹanalisi istologica dei reni a 18, 48, 72 h e 5, 8, 15 giorni dal danno.

RISULTATI

Lo strumento permette di misurare la fluorescenza emessa dalla Sinistrina-FITC inoculata. Impostando il livello del rumore di fondo e lʹistante di inizio del calcolo (deve essere oltre il 17min) si ottiene il tempo di T1/2 del marcatore. Come si può vedere (Figura 4) in seguito allʹinoculo del marcatore, vi è un picco del segnale di fluorescenza, che successivamente cala in base alla concentrazione intravasale della Sinistrina-FITC e quindi alla clearance. Andando a sovrapporre le curve ottenute dalle misurazioni effettuate, si può vedere come il T1/2 del marcatore varia con il procedere del recupero del danno acuto (Figura 5).

Nel corso dello studio sono stati utilizzati 14 topi SCID con peso medio di 24,3±2,0 g. Le misurazioni hanno evidenziato una netta riduzione del GFR rispetto alla valutazione basale, massimale (circa del 40%) nelle prime 18h dall’induzione del danno, quando il tempo di dimezzamento aumentava notevolmente (circa al 280%). A partire da 48 ore dopo danno si è evidenziata una graduale diminuzione del tempo di dimezzamento, con valori ritornati alla norma (circa 1300 µl/min/100g peso corporeo) a partire dal quinto giorno (Figura 3).

I livelli plasmatici di BUN e Crea (Figura 0) misurati nello stesso modello murino di AKI, hanno mostrato un picco a 18h. Dal punto di vista istologico, a 18h si possono vedere segni di iniziale necrosi con morte cellulare e distacco della membrana basale. Inoltre si osserva una modesta dilatazione tubulare che suggerisce una componente di ostruzione tubulare iniziale. A 48h si possono notare numerosi casts, segni di deposito proteico, all’interno dei tubuli prossimali. È inoltre presente necrosi tubulare diffusa e denudamento della membrana basale. Tali aspetti si rilevano anche 72 ore, quando si assiste ad un parziale riassorbimento dei casts (Figura 6). A 15 giorni l’aspetto morfologico dei reni appare nella norma (non mostrato).

CONCLUSIONI

La misurazione transcutanea della GFR ha dimostrato di essere un ottimo metodo per la comprensione della fisiopatologia dell’AKI da rabdomiolisi, nonché per il monitoraggio della funzionalità renale in modelli sperimentali murini. Tali risultati rappresentano una buona premessa per lo sviluppo di dispositivi utilizzabili anche a livello clinico, data l’assenza di tossicità della FITC-Sinistrina. La tecnica, inoltre, permette di misurare la funzionalitá renale senza dover sacrificare lʹanimale, procurargli stress attraverso continui campionamenti sanguigni o anestetizzarlo, evitando variazioni del GFR.