INTRODUZIONE

Il danno renale acuto (AKI) associato a sepsi è correlato non solo all'ipoperfusione tissutale ma anche all'azione tossica di mediatori infiammatori circolanti sulle cellule renali residenti. Diverse metodiche extracorporee si sono dimostrate in grado di rimuovere tali mediatori infiammatori. Tra di esse, il rene bioartificale (Renal Assist Device, RAD) con cellule epiteliali tubulari (TEC) vive ha dimostrato di possedere funzioni assorbitive, metaboliche ed endocrine. L’aggiunta del RAD alle terapie convettive convenzionali ha migliorato in trials clinici la mortalità di pazienti con AKI associata a sepsi.

Purtroppo, la vitalità delle TEC all'interno del RAD è limitata dalla scarsità di nutrienti e ossigeno. Perfluorocarbone (PFC) è una molecola carrier di ossigeno usata in alcune patologie polmonari e come liquido di conservazione  nel trapianto di organi, poichè in grado di mantenere la vitalità cellulare.

SCOPO DEL LAVORO

Gli scopi del presente studio sono valutare:

1. l’effetto protettivo di PFC sul danno indotto dal plasma settico sulleTEC

2. Il potenziale ruolo di PFC sulla differenziazione delle cellule staminali renali CD133+ 

MATERIALI E METODI

Campioni di plasma da 10 pazienti con AKI associata a sepsi (gruppo “Failure” RIFLE).

TEC e progenitori renali CD133 + sono stati isolati mediante cell sorting magnetico, posizionati su membrane in policarbonato rivestite di collagene e coltivate con RPMI supplementato con PFC (50% RPMI/ 50% PFC) (Figura 1). Le cellule sono state incubate con plasma settico, LPS (50 ng/ml) o citochine infiammatorie (20 ng/ml TNF-alpha + 30 ng/ml IFN-gamma).

Abbiamo valutato su TEC l’effetto del PFC sulla citotossicità indotta da plasma settico (XTT), apoptosi (TUNEL ed ELISA per caspasi-3, -8 e -9), polarità cellulare e internalizzazione di albumina. E’ stata inoltre eseguita l’analisi mediante immunofluorescenza/FACS per Fas, Fas-Ligand, ZO-1 e megalina.

Abbiamo valutato l’effetto di PFC sulla differenziazione dei progenitori renali CD133+ verso un fenotipo epiteliale/tubulare con immunofluorescenza/FACS per E-caderina, megalina, fosfatasi alcalina aminopaptidasi-A, aquaporina-1 (AQP-1) e lipocalina-2 (NGAL).

RISULTATI

PFC induce un significativo incremento della vitalità delle TEC coltivate per 7 giorni in stato di deprivazione sierica. Il plasma settico induce un diretto effetto pro apoptotico (Fig. 4) su TEC mediante attivazione di Fas (Fig. 5) e caspasi-3, -8 e -9 (Fig. 6). PFC inibisce in maniera significativa l’apoptosi di TEC indotta dal plasma settico o da LPS e citochine infiammatorie (Fig. 4-6). Inoltre, il plasma settico induce alterazioni funzionali in TEC come la perdita della polarità cellulare  (Fig. 7) e la ridotta capacità di internalizzare l’albumina (Fig. 8), con concomitante ridotta espressione di ZO-1 e megalina (Fig. 9).

PFC inibisce in maniera significativa tutte le alterazioni funzionali indotte dal plasma settico su TEC (Fig)

Sui progenitori renali CD133+., PFC induce la differenziazione  verso un fenotipo epiteliale/tubulare come dimostrato dall'acquisizione di polarità cellulare (Fig. 11) e di marcatori di TEC differenziate quali E-caderina, megalina, fosfatasi alcalina, aminopeptidasi A, aquaporina- 1 (AQP-1) and lipocalina-2 (NGAL) (Fig. 12).

CONCLUSIONI

Il trasportatore di ossigeno PFC protegge TEC dall’apoptosi indotta dai mediatori infiammatori circolanti presenti nel plasma settico attraverso l’inibizione dei pathways mitocondriali e recettoriali 

PFC induce la differenziazione dei progenitori renali CD133+ verso un fenotipo epiteliale/tubulare.

I nostri risultati suggeriscono l’utilizzo di PFC per migliorare il beneficio metabolico e clinico del RAD per il trattamento dell’AKI associata a sepsi ed il potenziale ruolo del PFC nei meccanismi riparativi in seguito ad AKI.