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IL FOSFOPROTEOMA DEI LINFOMONOCITI PERIFERICI (LMP): UNO STRUMENTO INNOVATIVO PER LO STUDIO DEL RIGETTO CRONICO ANTICORPO-MEDIATO (RCAM)

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INTRODUZIONE e OBIETTIVI

Il RCAM rappresenta una delle cause principali di fallimento del trapianto renale (Einecke G - 2009 [1] (full text)); Sellares J - 2012 [2] (full text)). La scarsa conoscenza dei meccanismi molecolari coinvolti nella sua patogenesi limita significativamente le potenziali strategie terapeutiche (Porcheray F - 2010 [3]). La diagnosi di RCAM è problematica a causa dei limiti intrinseci degli attuali criteri diagnostici (lesioni istologiche a livello del microcircolo tubulare e glomerulare, depositi di C4d a livello dei capillari tubulari, dosaggio sierico di anticorpi anti-HLA specifici del donatore) e della sua eterogenea evoluzione clinica (Loupy A - 2011 [4] (full text)). Mancano dei marcatori molecolari specifici non invasivi per una diagnosi precoce di RCAM. In questo contesto, l’analisi proteomica potrebbe fornire un signature molecolare (lista di proteine) in grado di distinguere i pazienti affetti da RCAM e contribuire a definire i meccanismi molecolari alla base di questa malattia. Questo studio si propone di identificare dei potenziali marcatori diagnostici di RCAM e/o i meccanismi molecolari coinvolti nella sua patogenesi mediante l’analisi del fosfoproteoma dei LMP. L’obiettivo finale è l’identificazione di network di segnali cellulari differentemente attivati in pazienti con RCAM.

METODI

5 pazienti con diagnosi istologica di RCAM secondo i criteri di Banff 2007, 7 pazienti trapiantati con normale funzione e istologia del trapianto (tx-CTRL) e 5 individui sani (CTRL) sono stati inclusi in questo studio pilota (TABELLA 1- Figura 6). I LMP sono stati isolati dal sangue intero raccolto al tempo dell’arruolamento dei pazienti mediante una separazione in gradiente di densità (Ficoll-PaqueTM) (Figura 1). Le fosfoproteine sono state isolate dai lisati cellulari mediante precipitazione con sali di lantanio (Pink M - 2011 [5]) separate mediante elettroforesi bidimensionale su gel (2D-PAGE), e visualizzate mediante colorazione fluorescente Sypro Red (Figura 1). La standardizzazione delle mappe fosfoproteiche dei LMP dei tre diversi gruppi studiati, e l’analisi differenziale di espressione delle fosfoproteine nei tre gruppi è stata effettuata mediante Image Master Platinum software. L’analisi di spettrometria di massa MALDI-TOF-MS/MS ha permesso l’identificazione ed il sequenziamento delle fosfoproteine.

RISULTATI

La resa in fosfoproteine ottenuta per i CTRL e per i pazienti è stata rispettivamente del 5.6 ± 4.4 % e del 3.6 ± 2.8 % (p = n.s.). Sono state standardizzate le mappe 2-DE del fosfoproteoma dei LMP dei CTRL e dei pazienti. L’analisi d’immagine dei gel di riferimento dei tre gruppi ha evidenziato 550 ± 78 spot proteici (CV = 26 %) nei CTRL, 409 ± 83 spot proteici (CV = 35 %) nei pazienti RCAM e 402 ± 22 spot proteici (CV = 10 %) nei tx-CTRL (Figura 2). Dati preliminari indicano 7 spot proteici, corrispondenti a 3 proteine, la cui espressione aumenta nei pazienti RCAM rispetto ai CTRL e ai tx-CTRL (Figura 2) e 3 spot proteici la cui espressione diminuisce nei RCAM rispetto ai CTRL e ai tx-CTRL (Figura 3). L’espressione di 4 spot proteici, corrispondenti a 1 proteina, aumenta in tutti i pazienti trapiantati rispetto ai CTRL (Figura 4). Inoltre l’espressione di 5 spot proteici aumenta nei tx-CTRL rispetto sia ai CTRL sia ai RCAM (Figura 5).

CONCLUSIONI

Questi dati preliminari suggeriscono l’utilità dell’analisi del fosfoproteoma dei LMP nel distinguere i pazienti RCAM dai soggetti sani e dai pazienti trapiantati con funzione renale stabile. Inoltre, l’identificazione di fosfoproteine differentemente espresse può indicare nuovi spunti per i meccanismi molecolari alla base del rigetto cronico mediato da anticorpi e nuovi potenziali target terapeutici.

release  1
pubblicata il  17 settembre 2013 
da Maria Teresa Rocchetti¹,², Paola Pontrelli², Federica Rascio², Marco Fiorentino², Anna Zito², Giovanni Stallone¹, Loreto Gesualdo², Giuseppe Grandaliano¹
(¹SC di Nefrologia, Dialisi e Trapianto, Dip. di Scienze Mediche e Chirurgiche, Università di Foggia; ²SC di Nefrologia, Dialisi e Trapianto, Dip. dell’Emergenza e dei Trapianti di Organo (DETO), Università di Bari “Aldo Moro” )
Parole chiave: rigetto cronico umorale
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