INTRODUZIONE

• L’iperglicemia cronica, tipica del diabete di tipo 2, causa lesioni renali nel 20-30% dei casi, e spesso evolve in nefropatia diabetica (ND), principale causa di insufficienza renale terminale.
• Le cellule tubulari giocano un ruolo cruciale nella patogenesi della ND, ma i danni dell’iperglicemia non sono ancora chiariti. Fra le vie metaboliche coinvolte nell’insorgenza della ND recentemente è emerso il ruolo della via dell’ubiquitinazione. In particolare, l’ubiquitinazione in lisina 63 (K63) è coinvolta nei meccanismi di comunicazione cellulari, regolando il traffiking delle proteine e l’attivazione delle vie di trasduzione del segnale (Figura  1).

SCOPO DEL LAVORO

Scopo del nostro lavoro è stato di utilizzare un approccio multi-omico per definire gli effetti dell’iperglicemia nella progressione del danno tubulare nella ND.

MATERIALI E METODI

• Cellule umane tubulari renali (HK2), in normo-glicemia (5,5 mM) e iper-glicemia (30 mM), sono state sottoposte ad analisi dell’espressione genica (U133A microarray Chip, Affymetrix).
• I dati ottenuti sono stati validati con qPCR e immunoblotting sugli estratti cellulari e immunoistochimica su biopsie renali di sei pazienti con ND e sei soggetti apparentemente normali.
• I lisati proteici cellulari sono stati utilizzati per immunoprecipitare le proteine ubiquitinate, isolare quelle ubiquitinate in K63 e identificarle mediante MALDI-TOF/MS-MS. I risultati ottenuti sono stati validati mediante microscopia confocale.

RISULTATI

Tra i 46 geni differentemente espressi nelle cellule HK2 in condizioni di iper-glicemia ottenuti dall’analisi microarray ci siamo soffermati su UBE2V1, una variante dell’enzima E2 della via dell’ubiquitinazione che interviene nella formazione di catene di ubiquitina legate tramite lisina 63 (K63), la cui aumentata espressione in iper-glicemia veniva confermata dalla qPCR (Figura 2).

Sia in vitro, mediante immunoblotting, che in vivo sulle biopsie dei pazienti con ND, abbiamo osservato un’aumentata espressione proteica di UBE2V1 (Figura 3) e di proteine ubiquitinate in K63 (Figura 4) rispetto ai controlli, con un incremento significativo a livello tubulare.

La caratterizzazione proteomica delle proteine ubiquitinate in K63 nelle cellule HK2 in iper-glicemia, ha permesso di identificare 28 proteine, le cui funzioni sono incluse in un unico network principale e coinvolte nell’organizzazione cellulare (Figura 5).

La microscopia confocale confermava un aumentata ubiquitinazione in lisina 63 dell’actina nelle cellule HK2 in condizioni di iperglicemia (Figura 6).

CONCLUSIONI

L’iperglicemia potrebbe causare nelle cellule tubulari alterazioni nella morfologia cellulare, dovute ad un alterato stato di ubiquitinazione in K63 del citoscheletro. Tali alterazioni fornirebbero una spiegazione molecolare alla progressione del danno tubulare in corso di DN e potrebbero indicare possibili marcatori predittivi e bersagli terapeutici.

DIDASCALIE FIGURE

Figura 1: Processo di ubiquitinazione.

Figura 2: L’alto glucosio induce un aumento dell’espressione genica di  UBE2V1 nelle cellule tubulari renali coltivate in basso glucosio, alto glucosio o L-glucosio come controllo osmotico.

Figura 3: A. Analisi dell’espressione proteica di UBE2V1 mediante western blotting in cellule HK2 coltivate in basso e alto glucosio per 24 ore. B. Analisi dell’espressione proteica tissutale di UBE2V1 mediante immunoistochimica, in soggetti sani e in pazienti con nefropatia diabetica di classe 1.

Figura 4: A. Analisi dell’espressione proteica delle proteine ubiquitinate in lisina 63 (K63) mediante western blotting in cellule HK2 coltivate in basso e alto glucosio per 48 ore. B. Analisi dell’espressione proteica tissutale delle proteine ubiquitinate in lisina 63 (K63) mediante immunoistochimica, in soggetti sani e in pazienti con nefropatia diabetica di classe 1.

Figura 5: Caratterizzazione proteomica delle proteine ubiquitinate in lisina 63 in cellule HK2 in condizioni di iperglicemia per 48h. A. Gli estratti proteici sono stati immunoprecipitati con un anticorpo anti-ubiquitina e blottati con un anticorpo anti-lisina 63. Le proteine cerchiate sono state identificate mediante MALDI-TOF. B. Analisi in silico del network funzionale nel quale sono incluse le proteine identificate.

Figura 6: L’alto glucosio induce un aumento dell’ubiquitinazione in lisina 63 dell’actina nelle cellule HK2 (microscopia confocale).