Il danno renale nel diabete mellito (DM), correla con un incremento di ubiquitina libera nelle urine dei pazienti (Papale M et al. 2010) [1]. Inoltre, abbiamo dimostrato che l’iperglicemia induce, nelle cellule tubulari renali, l'ubiquitinazione di specifiche proteine. L’ubiquitinazione in lisina 48 media la degradazione delle proteine mentre quella in lisina63 regola i processi metabolici ed il trafficking intracellulare (Tenno et al. Genes cells, 2004) [2]. In questo studio, descriviamo l’individuazione di un set di proteine ubiquitinate (UBI-prot) selettivamente escrete nelle urine dei pazienti con nefropatia diabetica (ND).
Le UBI-prot in lisina63 ed in lisina48 sono state purificate dalle urine di 20 controlli e 60 pazienti DM (20 normo-, 20 micro- e 20 macro-albuminurici) mediante immunoprecipitazione con un anticorpo anti-ubiquitina e analizzate mediante SDS-PAGE colorato con blu di Coomassie e/o immunoblotting con anticorpo specifico per la lisina63. Il confronto tra le condizioni descritte ha consentito di distinguere le UBI-prot in lisina63 ed in lisina48. Le UBI-prot in lisina63 (lys63-UBI-prot), identificate nelle urine dei pazienti ND, sono state confrontate con quelle individuate nelle cellule tubulari renali cresciute in iperglicemia. Le proteine comuni o funzionalmente correlate sono state identificate con MALDI-TOF/MS e validate.
Le UBI-prot risultano marcatamente escrete nelle urine dei pazienti ND, poco rappresentate nei pazienti microalbuminurici e quasi assenti nei normoalbuminurici. L'iperglicemia induce nelle cellule tubulari renali (HK2) un significativo incremento della poliubiquitinazione proteica. L'analisi bioiformatica dimostra che molte delle proteine identificate sono funzionalmente legate. In particolare alcune di queste proteine correlano il riarrangiamento del citoscheletro (b-actina), l'espansione della matrice extracellulare (collagene alfa-1) e il dismetabolismo (istone metil-transferasi).Uno dei marcatori individuati è stato validato, in vivo, nelle urine dei pazienti con nefropatia diabetica ed è risultato utile per distinguere la ND da altre malattie renali croniche (CKD).
La progressione del danno renale nel DM correla con un significativo incremento dell’ubiquitinazione proteica. La presenza di lys63-UBI-prot di origine tubulare nelle urine dei pazienti ND suggerisce un ruolo chiave del danno tubulare nella progressione della ND. L’identificazione e la validazione di tutte le UBI-prot potrebbe consentire una migliore comprensione della fisiopatologia del danno renale nel DM e la messa a punto di nuovi test diagnostici e pronostici.
Figura 1 L’ubiquitinazione urinaria correla con la progressione del danno renale
Profilo di ubiquitinazione urinaria di pazienti diabetici normoalbuminurici (NORMO) e microalbuminurici con (DN) e senza (MICRO) lesioni istologiche. I dati evidenziano la stretta correlazione tra danno renale e l’escrezione urinaria di proteine ubiquitinate.
Figura 2 L’iperglicemia induce un incremento dell’ubiquitinazione proteica nelle cellule HK2
Lo screening delle proteine uquitinate, isolate da cellule HK2 cresciute in normoglicemia (5.5.mM) e iperglicemia (30 mM), mostra un signigficativo incremento dell’ubiquitinazione proteica dopo stimolo iperglicemico. Le proteine differentemente espresse con maggiore significatività sono state ritaglaite dal gel e sequenziate mediante MALDI-TOF/MS/MS
Figura 3 L’analisi bioinformatica rivela pathways funzionali correlate con ubiquitinazione, iperglicemia e danno renale
Le proteine ubiquitinate dopo stimolo iperglicemico (figura 2) sono state sequenziate mediante MALDI-TOF/MS/MS e analizzate mediante il software bioinformatico String (http://string-db.org) per definire le interazioni funzionali. Le proteine inserite in pathways funzionali associate al danno renale sono state quindi validate (figura 4). La figura mostra un esempio di pathway funzionale che correla diverse proteine identificate con l’ubiquitinazione, l’iperglicemia e il danno renale
Figura 4 Validazione di uno dei biomarcatori identificati
Uno dei marcatori identificati in associazione con la patogenesi della DN (Figura 3) è stato validato nelle cellule HK2 (box A) e nelle urine dei pazienti DN (box B)
[1] Papale M, Di Paolo S, Magistroni R et al. Urine proteome analysis may allow noninvasive differential diagnosis of diabetic nephropathy. Diabetes care 2010 Nov;33(11):2409-15
[2] Tenno T, Fujiwara K, Tochio H et al. Structural basis for distinct roles of Lys63- and Lys48-linked polyubiquitin chains. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms 2004 Oct;9(10):865-75
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