Introduzione

L’anemia è una condizione patologica che si sviluppa precocemente in corso di insufficienza renale cronica (IRC) e peggiora progressivamente con la riduzione della filtrazione glomerulare ( Voormolen 2010 [1]). Con l’avvento nella pratica clinica degli agenti stimolanti l’eritropoiesi (ESA) si è avuto un notevole supporto nel trattamento dell’anemia nella gran parte della popolazione uremica; tuttavia, circa il 10 per cento dei pazienti risulta essere resistente al trattamento con ESA nonostante le ampie dosi somministrate (Eschbach 1989 [2];Kanbay  2010 [3] (full text)). Svariati fattori risultano implicati nell’ipo-responsività all’eritropoietina (EPO) sebbene livelli persistentemente elevati di markers pro-infiammatori siano attualmente considerati i principali attori dell’inadeguata risposta terapeutica (Barany 2003 [4], Goicoechea 1998 [5] (full text); Sitter 2000 [6] (full text), Wei 2007 [7]). Le citochine pro-infiammatorie  possono infatti determinare EPO-resistenza inibendo, in vitro, la crescita dei progenitori eritroidi (Taniguchi 1997 [8] (full text); Allen 1999 [9]; Cooper  2003 [10] (full text)) ed interferendo con l’omeostasi del ferro. Il legame nei leucociti polimorfonucleati (peripheral blood mononuclear cell, PBMC) tra l’EPO-α ed il suo recettore (EPOR) determina una down-regolazione di processi legati al quadro flogistico (Kristal 1999 [11]; Sela 2001 [12] (full text)Peraltro, la somministrazione di EPO determina anche un incremento dei livelli plasmatici di TNF-α ed IL-6 (Hojman 2009 [13]). Questi rilievi suggeriscono come l’effetto dell’EPO sui mediatori dell’infiammazione sia strettamente correlato con la fase e l’intensità del quadro infiammatorio presente in corso della somministrazione di quest'ultima.

Materiali e Metodi

In questo studio abbiamo effettuato valutazioni tramite tecnica macroarray al fine di identificare le differenze di espressione genica in PBMC, attivati o meno per mezzo di stimolo pro-infiammatorio (TNF-α), quando esposti all'azione dell'EPO-α. I buffy coats sono stati ottenuti da 10 donatori sani; i PBMC ottenuti da ogni soggetto sono stati divisi in 4 gruppi per gli esperimenti di microarray: 1) cellule di controllo; 2) cellule stimolate con TNF-α (10 ng/ml, 30'); 3) cellule stimolate con EPO-α (20 U/ml, 15'); 4) cellule pre-stimolate con TNF-α (10 ng/ml, 15') e poi incubate con EPO-α (20 U/ml, 15'). Esperimenti di real-time PCR sono stati utilizzati per validare l'espressione dei target molecolari considerati rilevanti nel processo infiammatorio (Figura 1).

Misurazioni quantitative delle citochine IL-1β ed IL-8 sono state eseguite per mezzo di tecnica ELISA.

Risultati

I risultati ottenuti dall'analisi in microarray hanno evidenziato che le funzioni biolgiche modulate dal trattamento con entrambi gli stimoli, da soli od in combinazione, coinvolgono funzioni chiave della regolazione del sistema immunitario. L'alterazione dell'espressione genica è principalmente implicata nella regolazione dello sviluppo cellulare e nei processi dinamici come il movimento cellulare e l'interazione cellula-cellula. Questi geni codificano per le chemochine CXCL1, CXCL5 e CCL8 (Figura 2).

La figura 2 mostra i valori di fold change (FC) per i mediatori succitati e per l'isoforma β dell'IL-1.

L'azione anti-infiammatoria dell'EPO-α è evidenziata dalla normalizzazione dell'espressione delle citochine IL-8 e dalla down-regolazione del suo recettore CXCR2. Inoltre, anche il gene codificante per la proteina FES coinvolta nella chemiotassi e nei processi ematopoietici, risulta significativamente down-regolata dopo incubazione con entrambi gli stimoli. Al fine di valutare quantitativamente le modificazioni dell'espressione genica evidenziate dall'analisi microarray, abbiamo effettuato esperimenti di PCR che mostravano trends di espressione sovrapponibili a questi ultimi. In particolare, l'espressione dell'IL-1β, significativamente indotta dal TNF-α, subiva un ulteriore incremento a seguito dell'incubazione con EPO-α.

Visti gli effetti controversi, evidenziati dai nostri dati, determinati dell'EPO-α sul processo flogistico, in particolare sull'up-regolazione dell' IL-1β ed IL-8 da parte del TNF-α, abbiamo eseguito ulteriori analisi sul meccanismo coinvolto in questo processo analizzando l'espressione delle MAPK p38a e della sua forma fosforilata (Manthey 1998 [14] (full text); Suzuki 2000 [15] (full text) (Figura 3).

Discussione e Conclusioni

Abbiamo focalizzato la nostra attenzione sulla modulazione dell'espressione genica esercitata dall'EPO-α sui PBMC attivati valutando, dal punto di vista funzionale, le chinasi coinvolte a livello post-recettoriale. I risultati ottenuti dall'analisi microarray evidenziano geni srettamente coinvolti con il segnale citochinico; abbiamo confermato, infatti, che le citochine pro-infiammatorie della famiglia dell'IL-1 esercitano vari effetti EPO-α indotti sui PBMC, siano essi in stato di attivazione ovvero di quiescenza. Le citochine IL-1α e β sono già state strettamente associate con l'induzione ed il mantenimento dello stato anemico in corso di IRC. In aggiunta, proponiamo le chemochine CXCL1, CXCL5 e CCL8 come nuovi potenziali biomarcatori per l'EPO-resistenza. Queste chemochine sono coinvolte nella chemiotassi leucocitaria contribuendo, in tal modo, al processo flogistico. Di contro, abbiamo osservato una modulazione negativa per importanti molecole coinvolte sia nelle prime fasi che nel mantenimento del processo infiammatorio, confermando i rilievi precedentemente descritti sugli effetti anti-infiammatori dell'EPO (Kristal 1999 [11]; Sela 2001 [16]), in particolar modo l'espressione ed il rilascio di IL-8 e del suo recettore CXCR2, significativamente down-regolati dopo applicazione di entarmbi gli stimoli. Nel complesso, i nostri risultati mostrano che gli effetti dell'eritropoietina sui mediatori dell'infiammazione siano in qualche modo controversi. Al fine di chiarire i meccanismi alla base di questi processi, abbiamo focalizzato la nostra attenzione sui processi post-recettoriali valutando l'espressione della MAPK p38. Abbiamo evidenziato come una potente e selettiva inibizione di questa chinasi incrementi notevolmente l'espressione dell'mRNA di IL-1β e la secrezione della citochina stessa in cellule attivate e trattate con EPO-α. L'esatto meccanismo d'azione dell'EPO-α su cellule attivate rimane ancora da chiarire. Scopo futuro del nostro studio è di integrare i dati di espressione ottenuti da queste prime valutazioni con l'analisi funzionale delle chinasi coinvolte. Inoltre, valuteremo in vivo i target molecolari rilevati al fine di confermare il loro coinvolgimento nei meccanismi sottostanti l'inadeguata risposta al trattamento eritropoietinico.