Il nerve growth factor (NGF) è un fattore di crescita che esercita un ruolo protettivo nelle cellule neuronali in numerose malattie degenerative del SNC e del SNP [1] (full text). Negli ultimi anni studi clinici hanno dimostrato che l’espressione tissutale e i livelli sierici di NGF sono aumentati in alcune malattie autoimmuni e infiammatorie croniche, incluse alcune forme di glomerulonefriti proteinuriche [2]. Tuttavia ad oggi gli effetti che gli elevati livelli della neurotrofina esercitano in tali malattie non sono stati ancora elucidati [3]. Inoltre studi in vitro condotti su diversi tipi cellulari dimostrano che il NGF è coinvolto nei meccanismi di fibrosi. Tuttavia non sono riportati in letteratura studi sull’effetto della neurotrofina nelle cellule tubulari renali umane. Pertanto in questo lavoro abbiamo indagato l’effetto che l’esposizione cronica al NGF induce nelle cellule tubulari renali HK2.
Cellule tubulari renali umane, HK-2; ELISA assay, western blot, qPCR, silenziamento genico (siRNAi), scratch test e saggi di co-immunoprecipitazione.
Nelle cellule HK-2 il NGF stimola la secrezione di TGFβ1 (Fig. 1A) e un aumento trascrizionale della sua espressione genica e proteica (Fig. 1B), poiché il pretrattamento con cicloesamide, noto inibitore della sintesi proteica, ne reversa l’up-regolazione (Fig. 1C). Inoltre l’esposizione cronica con NGF aumenta la motilità delle HK2 come risulta evidente dai risultati dello scratch test (Fig. 2A). Analogalmente il NGF up-regola l’espressione di alcuni marcatori mesenchimali (vimentin, N-cadherin,l’FSP-1) e down-regola il marcatore epiteliale E-cadherin (Fig. 2B). L’induzione NGF-indotta dell’espressione genica e proteica del TGFβ1 (Fig. 3A) e l’espressione genica dei marcatori di EMT è mediata sia da TrKA che da p75NTR, poiché il silenziamento del gene p75NTR, e il pre-trattamento con l’inibitore di TrKA, K252A, reversano gli eventi osservati (Fig. 3B-C). Saggi di real-time-PCR suggeriscono che la modulazione dei marcatori di EMT è mediata dall’up-regolazione del TGFβ1 NGF-indotta, poiché nelle cellule knocked-down per il gene di TGFβ1 l’effetto viene reversato (Fig. 4A). Per indagare la via di attivazione rapida responsabile dell’induzione del TGFβ1 NGF-indotta abbiamo valutato i livelli di fosforilazione delle proteine coinvolte nell’attivazione della via non classica (MAPK, JNK, p38) (Fig. 5A) e della via classica (SMAD3, SMAD4) (Fig. 5B) del TGFβ1. Come si evince dai dati ottenuti il trattamento a breve tempo con NGF induce la traslocazione nucleare delle SMAD3 complessate con le SMAD4 (Fig. 5C) mentre non si osserva alcuna attivazione della via non classica (Fig. 5A). La traslocazione nucleare del complesso SMAD3/SMAD4 viene in parte reversata in cellule trasfettate con il silencing del TGFβ1 (Fig.5D) e totalmente abrogata in cellule pre-trattate con un anticorpo neutralizzante anti-NGF (Fig. 5E).
I nostri dati dimostrano che nelle cellule tubulari renali il NGF, attraverso l’up-regolazione del TGFβ1 mediata dal signaling di entrambi i suoi recettori e della via delle SMAD, è un induttore di fibrosi.
[1] Aloe L, Rocco ML, Bianchi P et al. Nerve growth factor: from the early discoveries to the potential clinical use. Journal of translational medicine 2012 Nov 29;10:239 (full text)
[2] Bonofiglio R, Antonucci MT, Papalia T et al. Nerve growth factor (NGF) and NGF-receptor expression in diseased human kidneys. Journal of nephrology 2007 Mar-Apr;20(2):186-95
[3] Gigliotti P, Lofaro D, Leone F et al. High nerve growth factor blood concentration in renal transplantation: a new prognostic marker? Transplantation proceedings 2013 Sep;45(7):2654-6
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