La rapamicina attraverso l’inibizione del complesso proteico mTor esercita effetti antiproliferativi e immunosoppressivi. Studi in vitro dimostrano che nelle cellule tubulari renali, HK2, la rapamicina, attraverso l’attivazione dell’ autofagia, mitiga il danno pro-apoptotico indotto dalla proteinuria [1] (full text). Nostri studi in vitro hanno evidenziato che nelle HK2 la Ciclosporina A (CsA) aumenta l’espressione della neurotrofina NGF e che il trattamento cronico con NGF potenzia l’effetto nefrotossico della CsA attraverso l’arresto del ciclo cellulare e l’attivazione del pathway di morte del recettore del NGF, p75NTR [2] (full text). Studi preliminari hanno evidenziato che nelle HK-2 il trattamento cronico con rapamicina riduce la vitalità cellulare ma non induce apoptosi e che la rapamicina non modifica i livelli di NGF e del suo recettore di sopravvivenza TrKA, ma aumenta l’espressione genica del p75. Pertanto lo scopo del lavoro è stato quello di indagare se la riduzione della vitalità rapamicina-indotta è conseguente all’attivazione dell’autofagia e il coinvolgimento dell’asse NGF/TrKA/p75NTR nell’effetto biologico osservato.
Cellule HK2; MTT-assay; western blot; qPCR; DNA Ladder Assay; tecniche di silenziamento genico; trasfezioni transienti del promoter wt del gene p75NTR.
Saggi di MTT dimostrano che l’esposizione cronica a dosi crescenti di rapamicina riduce la vitalità cellulare delle HK2 dopo 72h (Fig. 1A) e 6 gg (Fig. 1B) di trattamento Tuttavia, analisi di qPCR non evidenziano l’attivazione genica e proteica di alcuni markers pro-apoptotici (p53, BAD) (Fig. 1C-D). L’assenza di apoptosi è confermata dal test del DNA Laddering che non mostra frammentazione del DNA (Fig. 1E). Pertanto abbiamo indagato se la riduzione della vitalità cellulare fosse legata all’innesco dell’autofagia. Dati di qPCR mostrano che il trattamento con rapamicina determina l’up-regolazione genica e proteica dei principali markers di autofagia Beclin 1 (Fig. 2A-B) e LC3 (Fig. 2C-D), pur non modulando ATG5 e ATG7 (Fig. 2E-F). che è noto non essere determinanti per l’innesco del processo autofagico. I nostri risultati dimostrano il ruolo cruciale che il recettore p75 esercita nell’upregolazione dei markers autofagici, poichè in cellule nelle quali abbiamo silenziato il gene p75 (Fig. 3A), l’attivazione di beclin (Fig. 3B) e di LC3 (Fig. 3C) risulta reversata. Infine, Studi di trasfezione transiente effettuati trasfettanto le HK2 con un plasmide contenente il promoter wt del recettore p75 dimostrano che l’upregolazione di p75 osservata sotto dosi farmacologiche di rapamicina (20nM) (Fig. 4A) è di tipo trascrizionale (Fig. 4B).
In accordo con i dati della letteratura che dimostrano che nelle cellule del Purkinje deprivate di neurotrofine l’attivazione di p75NTR induce autofagia [3] (full text), i nostri dati dimostrano che nelle Hk2, l’autofagia indotta dal trattamento con dosi farmacologiche di rapamicina è mediata dall’attivazione trascrizionale di p75NTR.
[1] Liu WJ, Luo MN, Tan J et al. Autophagy activation reduces renal tubular injury induced by urinary proteins. Autophagy 2014 Feb;10(2):243-56 (full text)
[2] Vizza D, Perri A, Lofaro D et al. Exposure to nerve growth factor worsens nephrotoxic effect induced by Cyclosporine A in HK-2 cells. PloS one 2013;8(11):e80113 (full text)
[3] Florez-McClure ML, Linseman DA, Chu CT et al. The p75 neurotrophin receptor can induce autophagy and death of cerebellar Purkinje neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 2004 May 12;24(19):4498-509 (full text)
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