Gli studi riportati in letteratura dimostrano che la proteinuria, marker di danno glomerulare, attraverso molteplici meccanismi, esercita un’azione citotossica sul tubulo renale. Alcuni studi suggeriscono che tra questi l’autofagia potrebbe rappresentare un meccanismo di protezione sulla cellula tubulare e che il trattamento in vitro con rapamicina, potenziando l’autofagia, potrebbe mitigare il danno apoptotico indotto dalla proteinuria. Scopo del lavoro è quello di testare nelle HK-2 se la rapamicina mitiga il danno indotto da elevate dosi di albumina e i meccanismi molecolari implicati.
Cellule HK-2; MTT-assay; laddering assay; western blot (WB); real-time-PCR (RT-PCR); silenziamento genico; trasfezioni transienti.
Saggi di MTT dimostrano che nelle HK-2 la rapamicina (20nM) riduce la vitalità cellulare attraverso l’attivazione dell’autofagia, come evidenziato dall’aumento dell’espressione genica e proteica di Beclin ed LC3II-III e non per eventi apoptotici come evidenziato dal test di frammentazione del DNA. Nelle medesime condizioni sperimentali saggi di RT-PCR, WB e di trasfezione transiente hanno dimostrato che la rapamicina attiva in maniera trascrizionale il recettore p75NTR il cui silenziamento genico abroga l’attivazione di Beclin ed LC3II-II. Saggi di MTT mostrano che il trattamento con albumina (5mg/ml) determina una riduzione della vitalità cellulare e l’attivazione dell’apoptosi confermata dal test di frammentazione del DNA. Nelle medesime condizioni sperimentali, saggi di RT-PCR e di WB evidenziano l’attivazione genica e proteica di markers proapoptotici (BAD-BAX) i cui livelli di espressione sono mitigati in cellule co-trattate con rapamicina. Infine, saggi di WB e di vitalità cellulare dimostrano che in assenza di p75NRT la rapamicina non mitiga il danno apoptotico indotto dall’albumina.
I nostri risultati individuano un nuovo meccanismo molecolare attraverso il quale l’autofagia indotta dalla rapamicina mitiga il danno proteinurico sul tubulo renale.
