Infiammazione, dIsfunzione endoteliale e calcificazioni vascolari sono elementi clinici caratteristicidei pazienti con insufficienza renale cronica avanzata (CKD). CKD è associata ad un elevato tasso di mortalità dovuto a molteplici co-morbidità ed in particolare a malattie cardiovascolari (CVD). I meccanismi patogenetici di CVD correlate a CKD non sono solo associati a fattori tradizionali quali ipertensione e dislipidemia, ma anche a disfunzione endoteliale e rilascio di mediatori pro-infiammatori circolanti a livello tissutale includendo tra questi le tossine uremiche idrosolubili e "protein-bound". Tra questi dannosi mediatori circolanti, le vescicole extracellulari plasmatiche (pEV)sono nanoparticelle che rappresentano un nuovo concetto di "cross-talk" inter-cellulare mediante trasferimento di proteine, mRNAs e microRNAs a diverse cellule bersaglio.
La nostra principale ipotesi di lavoro è rappresentata dall'idea che in ambiente uremico, pEV potrebbero agire in sinergia con le tossine uremiche nel favorire induzione di CVD, alterando la funzione delle cellule endoteliali (EC), delle cellule muscolari lisce (SMC) e dei progenitori endoteliali (EPC).
È stata effettuata l'analisi del plasma stoccato da 60 pazienti con CKD (stadio IV-V). pEV venivano analizzate mediante Nanotrack (tecnologia Nanosight) per determinarne concentrazione e dimensioni e mediante GUAVA FACS per determinare l'espressione delle molecole di superficie. EPC CD34+CD133+flk-1+ circolanti venivano inoltre analizzate mediante FACS su sangue periferico dei pazienti. pEV isolate da plasma di pazienti affetti da CKD mediante ultracentrifugazione venivano aggiunte ad EC, SMC ed EPC umane in coltura valutando l'apoptosi (TUNEL assay), l'angiogenesi (coltura su piastre "Matrigel-coated"), il rilascio di NO/VEGF e la capacità di calcificazione (colorazione rosso alizarina, Runx2, espressione mRNA).
In confronto a soggetti liberi da malattia, i pazienti con CKD (sia in stadio IV che V) mostravano un significativo incremento della concentrazione di pEV (p<0.05) (Figura 1 A). L'analisi FACS rivelava che pEV avevano origine da differenti tipi cellulari tra cui cellule endoteliali, monociti, neutrofili, linfociti B e T e piastrine (Figura 1 B). Inoltre, pEV esprimevano in superficie molecole coinvolte nei processi di infiammazione, apoptosi, coagulaizone e attivazione del complemento quali Tissue Factor (TF), il fattore terminale del complemento C5b-9, CD40-ligand, Fas-Ligand, NGAL, HLA di classe I e differenti proteine delle famiglie delle integrine e delle selectine (Figura 2 A). Il profilo RNA di pEV è attualmente in fase di investigazione. pEV correlavano inversamente con la percentuale di EPC CD34+CD133+flk-1+ circolanti. Si poteva invece assistere ad una correlazione diretta con i livelli plasmatici di omocisteina, ADMA e proteina C reattiva, marcatori di infiammazione e di danno endoteliale (dati non mostrati). In vitro, l'analisi FACS e in microscopia aveva dimostrato che pEV venivano internalizzate in EC, SMC ed EPC umane isolate (Figura 2 B). In EC, pEV incrementavano l'adesione leucocitaria (Figura 3 A), scatenavano l'apoptosi (Figura 3 B) e riducevano le loro proprietà pro-angiogeniche si piastre "Matrigel-coated" (Figura 3 C). Questi effetti potrebbero essere correlati alla riduzione indotta da pEV dell'espressione di eNOS e conseguente produzione di NO (colorazione DAF2-DA) (Figura 4 A) con concomitante incrementata generazione di ROS (Figura 4 B). In SMC, pEV aumentavano la capacità di calcificazione come attestato dalla colorazione rosso alizarina (Figura 5 A) e da qRT-PCR per l'espressione di mRNA Runx2 (Figura 5 B). In EPC, pEV inducevano apoptosi (Figura 6 A) e riducevano il rilascio di VEGF (Figura 6 B). Tutti gli effetti deleteri descritti indotti da pEV su EC, SMC ed EPC venivano incrementati dalla co-incubazione con tossine uremiche "protein-bound" quali p-cresyl solfato ed indoxyl solfato (Figure 3 - 6). Invece, le attività biologiche di pEV venivano ridotte significativamente a seguito del loro pre-trattamento con RNasi, enzima in grado di distruggere mRNA e microRNA presenti entro pEV (Figure 3 - 6).
Le concentrazioni di pEV sono significativamente aumentate in pazienti affetti da CKD avanzata. pEV originano da diverse tipologie cellulari e potrebbero agire in sinergia con le tossine uremiche "protein-bound" nel favorire lo sviluppo di danno e di alterazioni funzionali a livello di EC, SMC e EPC. Il trasferimento di specifici mRNA e microRNA da pEV a cellule bersaglio potrebbe svolgere un ruolo chiave nello sviluppo di infiammazione, disfunzione endoteliale, calcificazioni vascolari e CVD in pazienti affetti da CKD avanzata, rappresentando un moderno target diagnostico e terapeutico.
Progetto di ricerca vincitore di un contributo fondi di ricerca da parte della Società Italiana di Nefrologia nell'anno 2014. Gli autori ringraziano la SIN per tale decisione.
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