Introduzione

L’iperglicemia cronica, fattore patogenetico chiave nella nefropatia diabetica (ND), può modulare i processi di autofagia, contribuendo alla progressione del danno renale (Ding Y - 2015) [1] (full text). Il ruolo dell’autofagia nelle cellule tubulari prossimali in condizioni di iperglicemia è ancora controverso. Abbiamo precedentemente dimostrato che l’ubiquitinazione in lisina-63 gioca un ruolo fondamentale nella progressione del danno tubulare in ND; inoltre è stato dimostrato che l’ubiquitinazione in lisina-63 promuove la clearence autofagica delle proteine (Tan JM - 2008) [2] (full text).

Obiettivi

1. Indagare in vitro l’effetto dell’iperglicemia sulla modulazione dell’autofagia nelle cellule tubulari renali (HK2).
2. Valutare in vivo lo stato di autofagia nel diabete e nelle diverse classi di ND (classificate secondo Tervaert TW- 2010 [3] (full text)).
3. Stabilire il ruolo dell’ubiquitinazione in lisina-63 nella modulazione dell’autofagia nelle cellule tubulari renali in vitro (HK2) e in vivo.

Risultati

• L’iperglicemia (30 mM) in vitro induceva già a 24h un aumento dell’attività autofagica cellulare, dimostrato da una aumentata sintesi della proteina autofagica LC3 nella forma totale inattiva (LC3I) e una riduzione, per aumentato turn-over, della forma attiva (LC3II) (figura 1);
• Al fine di chiarire il ruolo dell’ubiquitinazione in lisina-63 nella regolazione dell’autofagia in condizioni di iperglicemia, abbiamo silenziato nelle cellule HK2 il gene UBE2v1 che codifica per un enzima E2 responsabile dell’ubiquitinazione in lisina-63; il silenziamento di UBE2V1 dopo 48h e 72h di incubazione con alto glucosio riportava a valori basali i livelli di espressione proteica della forma attiva LC3II, inibendo l’elevato turn-over della proteina indotto dall’alto glucosio (figura 2); 
• La microscopia confocale in vitro sulle cellule HK2 dimostrava: 1. un aumento della comparsa di vescicole autofagiche in condizioni di iperglicemia; 2. un maggiore accumulo di proteine ubiquitinate in lisina-63 in condizioni di iperglicemia, associato all’aumento delle vescicole autofagiche; 3. l’inibizione dell’ubiquitinazione in lisina-63 con l’inibitore specifico (NSC697923) induceva la scomparsa di vescicole autofagiche indotte dall’iperglicemia (figura 3);
• L’immunoistochimica in vivo su biopsie renali di pazienti affetti da diabete e da ND con diverso grado di danno renale mostrava un aumento dell’espressione di LC3 a livello tubulare già nei pazienti diabetici rispetto ai controlli; l’autofagia persisteva nelle diverse classi di ND e aumentava col progredire del danno renale, fino alla ND di classe IV caratterizzata da grandi vescicole autofagiche fuse che occupavano gran parte del citoplasma (figura 4); 
• L’immunofluorescenza in vivo nelle biopsie renali dei pazienti affetti da diabete e nelle diverse classi di ND mostrava che gli stessi tubuli positivi per accumulo di proteine ubiquitinate in lisina-63 erano caratterizzati da un aumento dell’autofagia, come dimostrato dall’aumentata espressione di LC3 (figura 5).

Conclusioni

In conclusione, i nostri dati dimostrano che l’iperglicemia cronica induce un aumento dell’autofagia in vitro ed in vivo; nelle diverse classi di ND l’autofagia correla con l’accumulo di proteine ubiquitinate in lisina-63.

Livelli di autofagia incontrollati potrebbero portare al danno tubulare attraverso la formazione di vescicole intracellulari, contribuendo alla progressione del danno renale nella ND.