La malattia policistica renale autosomica recessiva (ARPKD) è una nefropatia genetica rara, spesso associata a fibrosi epatica congenita, caratterizzata dallo sviluppo di cisti multiple nell’epitelio dei dotti collettori. È causata da mutazioni nel gene PKHD1, un gene molto grande, che mappa sul cromosoma 16. La complessità del gene, la presenza di numerosi siti di splicing alternativo e la marcata eterogeneità allelica rendono la tradizionale analisi molecolare oltre che difficoltosa, anche laboriosa e dispendiosa. Lo scopo del presente studio è stato quello di sviluppare e validare un test genetico basato sull’impiego di tecnologie di Next-Generation Sequencing (NGS), mediante l’utilizzo della piattaforma Ion Torrent PGM.
Il protocollo NGS è stato validato su una coorte di 26 soggetti: 13 a mutazione nota e 13 con fenotipo clinico ARPKD o portatori obbligati. Il disegno sperimentale ha previsto l’utilizzo di 122 ampliconi parzialmente sovrapposti suddivisi in due multiplex-PCR per la copertura del 99,88% del target. Per garantire la completezza del test diagnostico, la regione di 15bp scoperta dal design è stata sequenziata in Sanger.
Il protocollo NGS ha permesso di identificare correttamente tutte le mutazioni presenti nei pazienti con diagnosi molecolare nota mostrando una sensibilità del 100%. Inoltre, negli stessi, ha consentito di individuare 6 mutazioni aggiuntive, mai diagnosticate, confermate successivamente con sequenziamento Sanger. Questo test ha consentito, infine, di ottenere la caratterizzazione molecolare del gene PKHD1 nei soggetti privi di diagnosi molecolare e di eseguire con successo una diagnosi prenatale.
Il test sviluppato risulta accurato, robusto e molto più sensibile rispetto al sequenziamento convenzionale. Sebbene sarà necessario validare il protocollo su una casistica più numerosa, questo studio mostra che le tecnologie di NGS rappresentano uno strumento d’indagine molecolare, rapido ed economico, vantaggioso nell’ambito della diagnostica molecolare e della consulenza genetica.
