Tra i diversi calcoli renali quelli “molli” o “di matrice” sono molto rari (Stoller Ml - 1994 [1]) (Boonla - 2014) [2]. Essi sono costituiti da una sostanza mucosa, elastica, amorfa e radiolucente per la scarsa se non nulla componente minerale (Shah - 2009 [3]). Allo scopo di comprenderne la patogenesi abbiamo identificato le proteine che li compongono con un’analisi del profilo proteomico di 5 calcoli avvalendoci di due diversi approcci proteomici complementari: top-down and bottom-up (Scherl A - 2015 [4]).
Con la collaborazione di centri a Padova, Londra e Dubai sono stati individuati 4 pazienti dai quali sono stati rimossi chirurgicamente 5 calcoli (una paz ha fornito 2 calcoli in tempi diversi).
Nella strategia top-down le proteine sono state estratte dai calcoli con una soluzione acidica/aceto nitrile, separate e analizzate come proteine e peptidi non denaturati utilizzando una colonna C8 HPLC accoppiata ad uno strumento ESI-LTQ-Orbitrap-tandem mass spectrometry (MS/MS).
Nell’approccio bottom-up i campioni sono stati trattati con un tampone fortemente denaturante per omogeneizzarli e sonicarli. Dopo separazione con SDS-PAGE monodimensionale e tripsinizzazione i campioni erano analizzati in cromatografia liquida C18 e con ESI-LTQ-Orbitrap MS/MS.
Sono state inoltre condotte indagini di istopatologia e immunoistochimica su tessuto renale ottenuto da uno dei pazienti.
Nei 5 campioni sono state complessivamente identificate 142 proteine e peptidi non ridondanti.
Tra queste la defensina 1 neutrofilica, e le proteine S100-A8 and S100-A9 costituivano la componete principale di questi calcoli. Anche importante era la presenza di timosina beta-4, le proteoforme eterodimeriche, troncate, ossidate, fosforilate e acetilate di S100-A8/S100-A9, nonché granuline, e ubiquitina.
Le indagini istopatologiche su tessuto renale hanno confermato la presenza di infiammazione, con presenza di linfociti T CD3+ e linfociti B CD20+ nell'interstizio renale. Lo studio immunoistochimico ha confermato la presenza di calgranulina A e B (Figure 1, 2, 3, 4, 5).
I due diversi approcci proteomici ha permeso l’identificazione di proteine e le loro forme modificate post-translazionalmente consentendo di comprendere la composizione e l’origine di questi calcoli. La notevole rappresentazione di molecole infiammatorie suggerisce che un processo infiammatorio sia l’evento iniziale nella formazione dei calcoli molli e non la sua conseguenza. Inoltre, le modificazioni post-translazionali di S100-A8 e A9 nonché la presenza di timosina beta-4, granuline, ubiquitina depongono per l’intervento della immunità innata e di una vigorosa risposta contro-infiammatoria.
[1] Stoller ML, Gupta M, Bolton D et al. Clinical correlates of the gross, radiographic, and histologic features of urinary matrix calculi. Journal of endourology / Endourological Society 1994 Oct;8(5):335-40
[2] Boonla C, Tosukhowong P, Spittau B et al. Inflammatory and fibrotic proteins proteomically identified as key protein constituents in urine and stone matrix of patients with kidney calculi. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry 2014 Feb 15;429:81-9
[3] Shah HN, Kharodawala S, Sodha HS et al. The management of renal matrix calculi: a single-centre experience over 5 years. BJU international 2009 Mar;103(6):810-4
[4] Scherl A Clinical protein mass spectrometry. Methods (San Diego, Calif.) 2015 Jun 15;81:3-14
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