Login




Nefrologia pediatrica

IDENTIFICAZIONE DI GENI CANDIDATI NELLA DETERMINAZIONE DELL’IPODISPLASIA RENALE MEDIANTE SEQUENZIAMENTO ESOMICO

comunicazione

Figura 1 di 14.

Identificazione di geni candidati nella determinazione dell'ipodisplasia renale mediante sequenziamento esomico



Figura 2 di 14.

L’ipoplasia renale è uno dei quadri più severi di anomalia dello sviluppo del rene che fa parte dell’ampio spettro fenotipico delle CAKUT. E’ responsabile del 30-40 % delle insufficienze renale con esordio in età pediatrica. E’ caratterizzata da:

  • reni ecograficamente piccoli, al di sotto di 2 DS rispetto alla media, con diagnosi entro i 2 anni dalla nascita
  • deficit del numero di nefroni
  • riduzione o assenza della funzionalità renale
  • iperecogenicità dovuta alla presenza di tessuto immaturo, displasico ed è per questo che si può meglio definire come ipodisplasia renale (RHD)

(Weber S.- 2012; Chesnaye N. - 2014; Wühl E. - 2013) [1] [1]



Figura 3 di 14.

l’RHD può presentarsi in forma isolata o come parte di un quadro sindromico ( es. renal coloboma syndrome, o branchio oto renal syndrome). Spesso è associata ad altre anomalie delle alte o basse vie urinarie come il reflusso vescico ureterale e la giunzione pielo-ureterale.



Figura 4 di 14.

L’RHD è dovuta ad un difetto durante la nefrogenesi, in particolare ad alterazioni dei primi step di induzione della bozza ureterale, del branching dell’uretere stesso e della formazione dei nefroni.



Figura 5 di 14.

Sono note mutazioni causative di RHD in almeno 20 geni dello sviluppo renale, (mutazioni nei geni PAX2 e HNF1B sono le più frequenti) tuttavia la maggior parte dei casi resta senza diagnosi genetica. In effetti l’ampia eterogeneità di locus e l’espressività variabile per stesse mutazioni, sia inter che intrafamiliari, nonchè la complessità regolatoria del network genico, rendono difficoltosa la scoperta di nuovi geni candidati.



Figura 6 di 14.

Come parte di un progetto strategico di ateneo a carattere multidisciplinare, l’UOSD di Nefrologia Pediatrica, Dialisi e Trapianto di Padova ha scelto l’RHD come esempio di malattia genetica monogenica-oligogenica, sulla quale applicare le tecnologie NGS e un nuovo software di analisi dei dati.

A tale scopo abbiamo arruolato una popolazione di 20 soggetti pediatrici con RHD bilaterale, non sindromica, non familiare, associata o meno a VUR. In 13 casi è stato possibile arruolare anche i genitori sani. E’ stato eseguito sequenziamento dell’esoma con tecnologia Ion proton e coverage medio di 80X.

L’analisi dei dati è ancora in corso e viene condotta con il software in house “QueryOr” sviluppato in collaborazione con il gruppo di bioinformatica del CRIBI di Padova. Segue la validazione Sanger per le varianti osservate.



Figura 7 di 14.

Le varianti da validare dovranno superare i seguenti criteri di prioritizzazione:

  • cov >60X,
  • varianti che originano proteine tronche, poi missenso e splice variant (con predizioni di patogenicità), filtrando per modelli di eredità sia AD che AR.
  • le varianti con frequenze superiori all’1% vengono eliminate
  • le varianti annotate minor allele in reference vengono eliminate
  • revisione dei dati in letteratura

Questo filtro è stato applicato prima ad un pannello di 800 geni implicati nello sviluppo renale sia nell’uomo che nel topo e geni responsabili della determinazione di patologie renali, poi ai geni annotati nello sviluppo embrionale umano ed infine a tutto l’esoma.



Figura 8 di 14.

Questi sono i primi dati ottenuti dall’analisi dei 46 esomi con QueryOr:

  • 13 varianti sono arrivate allo step di validazione.
  • le 3 delezioni evidenziate, non hanno avuto conferma in Sanger, probabilmente sono il frutto di uno slittamento dell’allineamento dell’esoma.
  • di 6 varianti recessive si ha la conferma solo per quelle presenti nel gene INVS
  • 4 varianti missenso identificate nei geni cakut sono state invece confermate tutte.


Figura 9 di 14.

In particolare, due varianti missenso con predizione di patogenicità, una mai riportata e una a frequenza 0,002 nei database, sono state confermate rispettivamente nei geni SLIT2 e ROBO2, ligando e recettore espressi nelle prime fasi di induzione della bozza ureterale, come effettori negativi del pathway GDNF-RET. Mutazioni di questi geni sono già riportate in associazione a fenotipi CAKUT e recentemente anche associati RHD (Hwang DY,et al 2015; [5] Mitsioni AG, et al 2016 [6])



Figura 10 di 14.

Altre 2 mutazioni missenso con predizione complessivamente patogenetica sono state osservate nei fattori trascrizionali SALL1 e SIX2, attivatori della via GDNF-RET. In questo caso si tratta di una variante nuova per SALL1 e di una a frequenza rarissima per SIX2. Mutazioni di entrambi i geni si associano sia a forme sindromiche che isolate di RHD (Hwang DY et al, 2014 [7]; Weber S, et al 2008 [8]) . Nel caso di SIX2 si tratta di una variante ereditata da madre “sana”, ma è nota una bassa penetranza ed elevata variabilità di espressione per mutazioni di questo gene.



Figura 11 di 14.

 Infine le due varianti tronche di INVS in eterozigosi composta, indubbiamente patogeniche, sono state uno dei primi risultati di questo studio. Mutazioni recessive di questo gene si associano alla nefronoftisi infantile (NPHP2). Alcuni autori riportano una percentuale non trascurabile di pazienti con rene piccolo, ma non specificano se si tratti effettivamente di RHD, e i loro pazienti mutati presentano anche caratteristiche cliniche tipiche delle NPHP2 ( S. Lienpkamp et al 2010 [9]), quali situs inversus, difetti oculari e cardiaci, presenza di multiple microcisti renali, poliuria, polidipsia e coinvolgimento epatico. Il nostro paziente, in IRC dai 5 mesi, ha avuto diagnosi di RHD entro i primi due anni di vita, presentava ipertensione ed è stato trapiantato a 33 mesi, ma non presentava nessuna caratteristica tipica di NPHP2. INVS codifica per una proteina ciliare, espressa anche nello sviluppo renale e con un forte ruolo nella regolazione delle divisioni cellulari. Quindi si potrebbe essere di fronte ad un’ennesima dimostrazione di variabilità fenotipica: mutazioni di INVS potrebbero associarsi anche all’RHD isolata o l’RHD potrebbe considerarsi come una manifestazione da annotarsi in un ampio spettro della NPHP2. E’ stato condotto uno screening mutazionale di INVS su una popolazione di circa 50 pazienti con RHD mono e bilaterale: i risultati sono esposti nella sessione dei poster cartacei. Vi anticipo che sono state trovate altre 3 varianti molto rare, ma in eterozigosi.



Figura 12 di 14.

 Riassumendo i risultati preliminari di questo studio:

  • le delezioni osservate in 3 casi non sono state confermate e questo sottolinea l’importanza della validazione Sanger dei dati WES, anche con elevato coverage!
  • Nel 25% dei casi analizzati si è osservata e confermata una variante in un gene candidato, noto per associazione a CAKUT, spesso in forma sindromica
  • Nel restante 75% dei casi, re-includendo i falsi positivi, si proseguirà l’analisi dei dati allargando anche alle regioni di splicing. Inoltre data l’elevata presenza di varianti rare in geni coinvolti negli stessi pathway, si valuteranno anche modelli di ereditarietà oligo-multigenica


Figura 13 di 14.

In Conclusione: la diagnosi genetica di RHD permetterebbe di offrire tempestivamente strategie di trattamento e poter dare counseling genetico alla famiglia.

I nostri dati sottolineano l’eterogeneità genetica che sottende alla determinazione delle RHD isolate e suggeriscono la realizzazione di pannello di geni per diagnostica NGS delle RHD che comprenda i CAKUT-genes sindromiche e non, estendendo anche alle patologie cistich.



Figura 14 di 14.

Ringrazio l'UOSD di Nefrologia Pediatrica Dialisi e Trapianto di Padova, e tutto il gruppo Bioinfogen



BibliografiaReferences

[1] null

[2] Weber S Novel genetic aspects of congenital anomalies of kidney and urinary tract. Current opinion in pediatrics 2012 Apr;24(2):212-8

[3] Chesnaye N, Bonthuis M, Schaefer F et al. Demographics of paediatric renal replacement therapy in Europe: a report of the ESPN/ERA-EDTA registry. Pediatric nephrology (Berlin, Germany) 2014 Dec;29(12):2403-10

[4] Wühl E, van Stralen KJ, Verrina E et al. Timing and outcome of renal replacement therapy in patients with congenital malformations of the kidney and urinary tract. Clinical journal of the American Society of Nephrology : CJASN 2013 Jan;8(1):67-74 (full text)

[5] Hwang DY, Kohl S, Fan X et al. Mutations of the SLIT2-ROBO2 pathway genes SLIT2 and SRGAP1 confer risk for congenital anomalies of the kidney and urinary tract. Human genetics 2015 Aug;134(8):905-16

[6] Mitsioni AG, Siomou E, Bouba I et al. ROBO2 gene variants in children with primary nonsyndromic vesicoureteral reflux with or without renal hypoplasia/dysplasia. Pediatric research 2016 Jul;80(1):72-6

[7] Hwang DY, Dworschak GC, Kohl S et al. Mutations in 12 known dominant disease-causing genes clarify many congenital anomalies of the kidney and urinary tract. Kidney international 2014 Jun;85(6):1429-33

[8] Weber S, Taylor JC, Winyard P et al. SIX2 and BMP4 mutations associate with anomalous kidney development. Journal of the American Society of Nephrology : JASN 2008 May;19(5):891-903 (full text)

[9] Lienkamp S, Ganner A, Boehlke C et al. Inversin relays Frizzled-8 signals to promote proximal pronephros development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2010 Nov 23;107(47):20388-93 (full text)

release  1
pubblicata il  11 ottobre 2016 
da Susanna Negrisolo1, Andrea Carraro1, Giulia Fregonese2, Elisa Benetti2, Davide Meneghesso2, Germana Longo2, Giorgio Valle 3, Piergiorgio Gamba4, Luisa Murer1,2
(1 Laboratorio di Immunopatologia e Biologia Molecolare del Rene, Dipartimento di Salute della Donna e del Bambino, Università di Padova, Padova 2 U.O.S.D Nefrologia Pediatrica, Dialisi e Trapianto, DAI Salute della donna e del bambino, Az Ospedaliera di Padova, Padova 3 CRIBI, Centro di Biotecnologie, Università di Padova, Padova 4 Chirurgia Pediatrica, DAI Salute della donna e del bambino, Az Ospedaliera di Padova, Padova)
Parole chiave: cakut
Non sono presenti commenti

Per inserire una domanda, segnalare la tua esperienza, un tuo commento o una richiesta di precisazione fai il login con il tuo nome utente e password.

Se non lo sei ancora puoi registrati partendo da qui.

Realizzazione: TESISQUARE®

Per assistenza scrivere al Supporto Tecnico