Evidenze sperimentali dimostrano che nelle cellule del tubulo prossimale renale, HK2, l’aumento del processo autofagico rapamicina-indotto, riduce il danno apoptotico causato dalla proteinuria (Yorimitsu T 2006; Scherz-Shouval R 2007; Wei Jing Liu 2014 [1] (full text)). Noi abbiamo osservato che nelle HK2 basse dosi di rapamicina aumentano l’espressione del recettore p75NTR che può mediare autofagia. Pertanto, abbiamo indagato il ruolo del p75NTR nell’effetto autofagico rapamicina-indotto in cellule HK2 esposte ad alte dosi di albumina.
Cellule HK-2, real-time-PCR (RT-PCR), western-blotting (WB), silenziamento genico, trasfezione.
I risultati ottenuti tramite RT-PCR e WB dimostrano che l’up-regolazione genica e proteica di Belin-1 e di LC3I-II rapamicina-indotta (7ng/ml) è reversata in HK2 in cui abbiamo silenziato il gene di p75NTR (HK2siRNAp75NTR). Il saggio dell’annessina e i dati di WB evidenziano, rispettivamente, che nelle HK2 esposte ad albumina (8mg/ml) il cotrattamento con rapamicina riduce la percentuale di cellule apoptotiche ed up-regola beclin-1 ed LC3I-II, rispetto al solo trattamento con albumina. Tali effetti non sono rilevati in cellule HK2siRNAp75NTR.. Le HK2 sono state trasfettate con un costrutto contenente il promoter del p75NTR wild-type e con costrutti deleti, dimostrando sempre l’aumento dell’attività del promoter e suggerendo che l’ultima parte del promoter è cruciale per la sua attivazione. Dopo avere individuato i siti responsivi presenti su tale porzione, tramite WB, eseguito su estratti citosolici e nucleari di HK2 trattate con rapamicina, abbiamo osservato che essa promuove la traslocazione nucleare del solo fattore di trascrizione EGR1.
I nostri risultati dimostrano che dosi di rapamicina incluse nel range terapeutico del trapianto renale mediano autofagia attraverso l’attivazione trascrizionale di p75NTR.
[1] Scherz-Shouval R, Shvets E, Fass E et al. Reactive oxygen species are essential for autophagy and specifically regulate the activity of Atg4. The EMBO journal 2007 Apr 4;26(7):1749-60 (full text)
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