Razionale

Un crescente numero di lavori ha dimostrato che eritropoietina (EPO) possiede, in aggiunta alla sua attività eritropoietica, effetti antiapopotici e immunoregolatori. Il nostro contributo recente dimostra che EPO inibisce la proliferazione dei linfociti T umani antagonizzando il signaling dell'IL-2. Gli effetti sono mediati direttamente tramite l’attivazione del recettore omodimerico dell’EPO (EPO-R) espresso sulla superficie delle cellule T come dimostrato da studi con antagonisti recettoriali (Cravedi P. et al,2014 [1] (full text)).

Il rene, che costituisce la principale fonte di EPO nell'adulto, è esposto ad alte concentrazioni di NaCl.  Lavori recenti hanno dimostrato che NaCl induce Th17 attraverso l’attivazione di SGK1 e accelera la progressione della malattia in un modello di encefalomielite autoimmune (Kleinewietfeld M et al., 2013 [2]).

Non e' noto se gli effetti immunosoppressivi di EPO, identificati a concentrazioni di NaCl pari a quelli sierici, persistono in presenza di alte concentrazioni di NaCl.

Metodi

Abbiamo isolato PBMC da volontari sani mediante separazione su gradiente di densità di Ficoll-Paque. Abbiamo poi ottenuto cellule T CD4⁺ naïve e CD8⁺ che, negli esperimenti di proliferazione, sono state marcate con CFSE e poi stimolate con anticorpi monoclonalti anti-CD3/anti-CD28 (15 μl/10⁶ cellule), o con cellule B allogeniche (2×10⁵ per pozzetto). In altri esperimenti, le cellule T naïve CD4⁺ sono state coltivate in condizioni polarizzanti per Th17 [anticorpi anti-CD3/anti-CD28 (10 ug/ml), IL-6 (10 ng/ml), TGF-β (10 ng/m), IL-1b (10 ng/ml), IL-23 (10 ng/ml), IL-21 (5 ng/ml), anticorpi anti-IL4 (10ug/ml) e anti-INF-γ (10ug/ml)] o per Treg [anti-CD3 (1 μg/ml), IL-2 (10 ng/ml) e TGF-β (10 ng/ml), in presenza di monociti] in medium X-VIVO15 per 5 giorni a 37 °C al 5% CO₂. In tutti gli esperimenti, le cellule sono state trattate con medium di coltura standard, crescenti concentrazioni di NaCl (20-40mEq/L) o urea (40-80mEq, controllo osmolare) ± EPO (1000 IU/ml) e analizzate con citometria a flusso.

Abbiamo valutato la funzione delle Treg in suppression assay e la loro stabilita' (persistenza dell'espressione di FoxP3 in assenza di TGF-β). Sono stati valutati i livelli di apoptosi cellulare tramite staining con annessina V e Fixable Viability Dye. Abbiamo anche valutato l'effetto di NaCl sull'espressione dell'EPO-R e il signaling intracellulare in cellule T, attraverso la quantificazione di pSGK1.

I dati di citofluorimetria sono stati analizzati con Software Cytobank e le analisi statistiche sono state effettuate con GraphPad Prism Software, Inc. I gruppi in studio sono stati comparati tramite t test. Sono stati considerati significativi i valori con P < 0,05.

Risultati

EPO previene l’aumento della proliferazione di cellule T CD4+ (127,0±10,3% vs 81,6±5,4%, NaCl40mEq+veicolo/medium vs. NaCl40mEq+EPO/medium; P<0,05) e CD8+ (103,8±7,8% vs 77,8±9,0% NaCl40mEq+veicolo/medium vs. NaCl40mEq+EPO/medium; P<0,05) indotto da NaCl (Figura 1A) e il numero di cellule positive per IFN-γ indotto da NaCl rispetto a medium standard o urea (210%±1,9 vs 89,6%±4, NaCl40mEq+veicolo/medium vs. NaCl40mEq+EPO/medium; P<0,05). Questo risultato non e’ legato ad un effetto di EPO sulla sopravvivenza delle cellule CD4⁺ e nella percentuale di cellule in apoptosi (88,1±17,3% vs 71,0±9,6% NaCl40mEq+veicolo/medium vs. NaCl40mEq+EPO/medium; ns) o necrosi (82,1±16,4% vs 74,0±8,7% NaCl40mEq+veicolo/medium vs. NaCl40mEq+EPO/medium; ns) in seguito a trattamento con NaCl e urea.

NaCl aumenta la conversione di cellule di cellule T naïve CD4⁺ in cellule Th17, un fenomeno che è prevenuto in presenza di EPO (593,9±237,7% vs 352,1%±77,1% NaCl40mEq+veicolo/medium vs. NaCl40mEq+EPO/medium; ns).

EPO aumenta la conversione di cellule T naïve CD4 in cellule Treg (CD4⁺ CD25⁺ FoxP3⁺), effetto amplificato in presenza di NaCl (Figura1B) (101,3±2,6% vs 226,8±15,9% NaCl40mEq+veicolo/medium vs NaCl40mEq+EPO/medium; P<0,05). Treg indotte in presenza di EPO sono in grado di inibire l’espansione di PBMC attivati con anticorpo anti-CD3 (suppression activity con Treg:Tconv 1:4= 46,9±2,3%). NaCl ed EPO non modificano la stabilita' delle cellule Treg (80,9±6,9% vs. 83,07±7,1%, Treg FoxP3⁺ dopo 3giorni di coltura senza TGFb con vs senza EPO, rispettivamente).

I livelli di EPO-R non sono modificati da NaCl (3,6±0,8 vs.3,8±1,7, MFI/isotipo con NaCl40mEq vs. medium; ns). EPO previene l’aumento di pSGK1 in cellule T CD4⁺ indotto da NaCl (aumento di MFI a 60 min/basale: 45,0±4,7% vs. 12,0±2,9%, in NaCl40mEq+veicolo vs. NaCl +EPO; P<0,05).

Conclusioni

I nostri dati indicano che EPO antagonizza l’effetto pro-infiammatorio del sodio, inibendo direttamente le cellule Th1 e Th17 e promuovendo l’induzione di Treg. Da un punto di vista meccanicistico, EPO inibisce la fosforilazione di SGK1 indotta da NaCl. Questo suggerisce che a livello renale, dove massime sono le concentrazioni sia di NaCl che di EPO, EPO potrebbe svolgere un’azione di tolleranza periferica, analoga all’acido retinoico a livello intestinale  (Cassani B. et al., 2011 [3]).

I nostri studi costituiscono un importante razionale per ulteriori lavori volti a caratterizzare ulteriormente gli effetti immunosoppressivi di EPO e ad esplorarne le potenzialità terapeutiche come molecola antiinfiammatoria.