Aumentati livelli di acido urico (AU) sono in grado di predire sviluppo e progressione di malattia renale cronica (MRC) e si associano a segni di danno renale (albuminuria, aumentati indici di resistenza, atrofia tubulare). I meccanismi di tossicità tubulare riconducibili all’AU non sono ancora chiariti. Scopo dello studio è indagare la capacità dell’AU di indurre apoptosi (noto meccanismo di danno in MRC) in cellule tubulari prossimali umane (hPTCs).
hPTCs (HK-2) sono state esposte a diverse concentrazioni di AU (7.5-12 mg/dl) per 48 ore. La vitalità cellulare è stata valutata mediante MTT, l’apoptosi mediante immunocolorazione per il frammento p17 della caspasi-3, l’espressione delle proteine Bax e Xiap con western blot, le variazioni del potenziale di membrana mediante colorazione con mitocapture, e l’espressione di composti ossidanti mediante colorazione con DCFH-DA. È stata studiata la risposta di HK-2 all'AU dopo incubazione con inibitori dell'URAT 1 e anche dopo aver transfectato le cellule con 60 nM di siRNA specifico per URAT 1.
L’AU (12 mg/dl) ha ridotto la vitalità cellulare (-30%, p=0.015) e incrementato le cellule apoptotiche (14%±0.35 vs 2%±0.87, p=0,0001). L’inibizione delle Caspasi-9 (Z-LEHD-FMK) e -3 (DEVD-CHO), ma non della Caspasi-8 (Z-IEDT-FMK), impediva la comparsa dell’apoptosi indotta da AU (Figura 1). L’espressione di Bax era aumentata, mentre quella di Xiap ridotta (-30% p<0.05). I mitocondri erano intatti nel 95% delle cellule di controllo e solo nel 70% di quelle esposte all’AU (p<0.05) (Figura 2). L’AU ha indotto stress ossidativo: il 10.90% ± 1.550 delle cellule era DCFH-DA positive, contro il 2.200% ± 0.4789 del controllo (p=0.003). Il pretrattamento con DPI (inibitore NADPH ossidasi) riduceva significativamente la morte cellulare per apoptosi (-70%, p=0.0001) mentre quello con antagonisti del trasporto intracellulare dell’AU (probenecid 20 µM e losartan 10 µM) riportava l’apoptosi a livelli del controllo (p<0.01 and <0.0001, rispettivamente). Quando l'espressione di URAT 1 veniva silenziata, l'apoptosi indotta dall' esposizione all'AU veniva significativamente ridotta rispetto a quanto avveniva nelle cellule trasfettate con siRNA non specifici (7±0.7% vs 14±1.5%, p<0.001) (Figura 3).
Livelli moderatamente elevati di AU promuovono l’apoptosi in hPTCs attivando la via intrinseca della Caspasi, contribuendo in tal modo alla perdita cellulare. Questa via mitocondriale viene inibita sia dal silenziamento dell' URAT 1, sia da farmaci come losartan e probenecid che attraverso il loro legame all’URAT-1 riducono l'internalizzazione dell'AU.
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