Il trapianto di insule pancreatiche è un opzione terapeutica per il trattamento di pazienti affetti da diabete di tipo I. Nonostante diverse innovazioni tecniche, sono ancora necessari pancreas di donatori multipli per garantire una massa di insule sufficiente per ottenere l'insulino indipendenza, dal momento che un gran numero di insule non attecchisce a livello epatico a causa del basso tasso di rivascolarizzazione. Le insule rilasciano un gran numero di fattori paracrini capaci di limitare le complicanze diabetiche, incluse le microvescicole (MV), piccole particelle che giocano un ruolo chiave nella comunicazione inter-cellulare attraverso il trasferimento di proteine e RNA alle cellule target. Le MV sono particolarmente arricchite di microRNA (miRNA), piccoli RNA non codificanti capaci di modulare la traduzione proteica.
Gli obbiettivi di questo studio sono:
1) L'isolamento e la caratterizzazione delle MV derivanti da insule pancreatiche umane;
2) La valutazione degli effetti delle MV sulle cellule endoteliali umane insulari (IEC) e renali, cellule mesangiali, podociti e cellule epiteliali tubulari.
Le MV sono state isolate mediante ultracentrifugazione da insule pancreatiche umane scartate per uso clinico e caratterizzate mediante Nanosight, FACS, western blot, Bioanalyzer and RT-PCR per geni specifici insulari o microRNA (miRNAs).
Sono stati valutati i seguenti effetti delle MV insulari su differenti tipi cellulari:
a) trasferimento dell'insulina a livello proteico e a livello di mRNA; b) proliferazione (saggio BrdU); c) resistenza all'apoptosi (saggio tunel); d) angiogenesi in vitro su piastre rivestite di matrigel; e) migrazione cellulare (video microscopia time-lapse); f) profilo mRNA e proteico di differenti tipi cellulari in presenza di MV insulari.
Le MV insulari sono state isolate dal medium condizionato di insule pancreatiche scartate per uso clinico (Fig 1A e B). Le MV mostrano una dimensione media di 155±73 nm (Fig. 1C) e esprimono diverse integrine (α4, α6, β1, αVβ3), CD44, ICAM-1, L-selettina and HLA I (Fig. 1D). Come mostrato dall'analisi western blot in Fig. 2A, le MV esprimono anche insulina, C-peptide, AKT, Ago-2 e CD63 (marker esosomale). L'analisi bioanalyzer evidenzia la presenza di differenti subset di RNA nelle MV insulari (Fig.2B). In particolare, le MV trasportano 208 differenti miRNA (200 condivisi e 8 non detectabili nelle insule da cui derivano, Fig. 2C), piccoli RNA non codificanti di meno di 22 nucleotidi in grado di modulare la traduzione proteica, inclusi miR-7 e miR-375 specifici per le beta cellule e miR-126 e miR-296 pro-angiogenici (non mostrati). Nelle MV sono stati identificati inoltre diversi mRNA codificanti per trasportatori/recettori specifici insulari come il recettore per l'insulina, PDX1, IRS2, AKT2 (Fig. 3A). Le MV sono internalizzate efficientemente nelle IEC, inducendo l'espressione dell'insulina sia a livello proteico, sia a livello di mRNA (Fig. 3B-D). Il pre-trattamento delle MV con 1U/ml di RNase abolisce il trasferimento del mRNA dell'insulina alle IEC (Fig. 3D). Dopo l'internalizzazione nelle IEC, le MV inducono una proliferazione dose-dipendente (Fig. 4A), resistenza all'apoptosi (Fig. 4B), migrazione (Fig. 4C) e aumento dell'angiogenesi in vitro (Fig. 4D-E). Tutti gli effetti biologici sono diminuiti significativamente dal pre-trattamento delle MV con 1U/ml di RNase, suggerendo un ruolo chiave del trasferimento di RNA dalle MV alle IEC (Fig. 4A-E). L'effetto pro-angiogenico delle MV sulle IEC è mediato dall'up-regolazione di geni pro-angiogenici e anti-apoptotici come VEGFR1, Angiopoietina-1, p-eNOS, p-ERK, p-AKT, BCL-2 come mostrato a livello di mRNA dal gene array (Fig.5A-B) e a livello proteico dal western blot (Fig. 5C). Un simile effetto pro-angiogenico delle MV è stato osservato sulle cellule endoteliali renali (non mostrato). Infatti, le MV insulari sono internalizzate nelle cellule endoteliali glomerulari, nei podociti, nelle cellule mesangiali e tubulari. Le MV riducono la produzione di TGF-beta da parte delle cellule mesangiali e tubulari incubate con alto glucosio (HG) (Fig. 6B). Inoltre, le MV riducono l'apoptosi indotta da HG nelle cellule endoteliali, mesangiali, tubulari e podociti (Fig. 6C). Tali effetti sono ridotti dopo trattamento delle MV con RNase o dopo transfezione delle cellule target con antagonisti diretti di miR-21 e miR-192, miRNA in grado di modulare l'espressione di TGF-beta e l'apoptosi (Fig. 6B-C).
Le insule pancreatiche umane rilasciano MV biologicamente attive capaci di trasportare specifiche proteine, mRNA e microRNA in diverse cellule target. Le MV esercitano un effetto pro-angiogenico sulle cellule endoteliali insulari, suggerendo un ruolo nel cross-talk beta cellule-endotelio e nei processi di neo-angiogenesi in seguito a trapianto di insule pancreatiche. Le MV potrebbero proteggere dalla nefropatia diabetica dopo il trapianto di insule pancreatiche attraverso il trasferimento del loro contenuto di RNA alle cellule glomerulari e tubulari renali danneggiate da HG.
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