INTRODUZIONE

La nefropatia diabetica (ND) è una frequente complicanza del diabete mellito. Se non riconosciuta e trattata adeguatamente, la malattia progredisce fino a determinare insufficienza renale terminale. Proteinuria ed alterata velocità di filtrazione glomerulare rappresentano i sintomi clinici della malattia. E’ fondamentale tuttavia la conferma della diagnosi attraverso un esame del campione bioptico in cui si riscontrano le seguenti lesioni caratteristiche: proliferazione delle cellule mesangiali, apoptosi dei podociti, ispessimento della membrana basale glomerulare, depositi di matrice extracellulare.

I microRNA (miRNA) sono piccole molecole di RNA non codificante a singolo filamento che modulano l’espressione proteica attraverso un meccanismo di regolazione post-trascrizionale. Estremamente conservati evolutivamente, i miRNA regolano almeno un terzo dell’intero genoma. Dato che un singolo miRNA possiede centinaia di target, l’alterazione nell’espressione di queste molecole influenza profondamente l’ambiente cellulare circostante. Biogenesi e meccanismo d'azione dei miRNA sono schematizzati in Figura 1.

L’importanza dei miRNA a livello renale fu provata attraverso la delezione specifica, a livello podocitario, dell’ enzima Dicer, fondamentale durante la biogenesi di queste molecole (Shi, 2008 [1] (full text)). Successivamente diversi miRNA sono stati identificati in svariati modelli animali e cellulari di DN. 

SCOPO del LAVORO

Scopo del nostro lavoro è stato la caratterizzazione di miRNA a livello renale umano in pazienti con diagnosi di ND istologicamente comprovata. A partire da un gruppo selezionato di biopsie renali fissate in formalina abbiamo estratto l’RNA totale per confrontare il profilo di espressione dei miRNA in pazienti con ND rispetto ai controlli. Alcune delle caratteristiche cliniche dei pazienti arruolati sono riassunte nella Figura 2.

RISULTATI

I risultati dell’analisi dell’intero miRNoma ottenuti con tecnologia microarray sono raffiguati nella Figura 3. 

La successiva analisi attraverso PCR quantitativa ha consentito la validazione di 18 miRNA la cui espressione è, in tutti i casi, aumentata nei ND rispetto ai controlli. Il box-plot dei miRNA validati è mostrato nella Figura 4. 

Il dataset di miRNA così ottenuto è stato valutato in termini di impatto sui target già validati ed altamente predetti di ciascuna entità. Ciò ha consentito l’identificazione di due proteine: PTEN e VEGF come bersagli ricorrenti dei miRNA in ND. Il ruolo di queste due proteine in ND era già noto in letteratura (Guan F, 2006 [2] (full text); Sison K, 2010 [3] (full text); Mahimainathan L, 2006 [4] (full text)). L’associazione di un profilo già pubblicato di espressione genica del rene diabetico (Woroniecka KI, 2011 [5] (full text)) al dataset dei miRNA da noi identificato ha poi suggerito una possibile repressione di due proteine: la guanilato chinasi membrana-associata (MAGI2), recentemente identificata come uno dei componenti dello slit diaphragm podocitario (Lehtonen S, 2005 [6] (full text)); e la solfatasi 1 (SULF1), che agisce modulando l’azione di importanti componenti della matrice extracellulare (Kolset SO, 2012 [7]).

Tra i miRNA validati, il miR-140-5p ha come target validato il VEGF e come target altamente predetti sia MAGI2 che SULF1. Abbiamo quindi valutato il livello di espressione del miR-140-5p nell’RNA renale di topi resi diabetici mediante iniezione di streptozotocina. Anche in questo modello animale di ND, si osserva un aumento di questo miRNA (Figura 5).

CONCLUSIONI

Attraverso l'utilizzo di tecnologia microarray abbiamo identificato 76 miRNA differenzialmente espressi in ND rispetto ai controlli. 18 miRNA risultano indotti anche dai risultati di PCR quantitativa. Alcuni target validati di questi miRNA sono già noti per il loro ruolo nella progressione della malattia mentre altri potrebbero rivelarsi cruciali per la regolazione dei meccanismi di filtrazione glomerulare e nel rimodellamento della matrice extracellulare.