Eparanasi (HPSE) è una endo-β-D-glucuronidasi che taglia l’eparan-solfato e partecipa alla degradazione della matrice-extracellulare favorendo il rilascio di fattori trofici (FGF-2, TGF-β) (Ilan N. 2006 [1]). TGF-β è uno dei principali attivatori di fibrosi tubulo-interstiziale mediante la transizione epitelio-mesenchima (EMT). HPSE controlla la EMT dei tubulociti indotta da FGF-2 (Masola V. 2012 [2] ) e il topo-ko per HPSE non sviluppa nefropatia diabetica nonostante gli elevati livelli renali nella nefropatia diabetica di TGF-β (Gil N. 2012 [3]). Lo scopo di questo studio è indagare come HPSE possa modulare l’espressione e gli effetti di TGF-β.
Cellule HK-2 wt e silenziate per HPSE sono state trattate per 6 ore con 60mg/ml di albumina (BSA), 60mg/ml prodotti di avanzata glicazione (AGE-BSA) e 10ng/ml FGF-2 in presenza o meno di eparina a basso peso molecolare (LMWH) come inibitore dell'HPSE (50μg/ml). Le cellule sono state inoltre trattate con 10ng/ml TGF-β per 6, 24, 48 e 72 ore (e fotografate). L’espressione genica di TGF-β e dei marcatori mesenchimali α-SMA, vimentina (VIM), fibronectina (FN) e MMP-9 è stata valutata mediante real-time PCR. L’attività di MMP-9 è stata misurata, nei mezzi condizionati, mediante zimografia. La migrazione cellulare è stata valutata mediante "scar-assay" e il rilascio di TGF-β nei mezzi condizionati è stato misurato mediante saggio ELISA.
Il trattamento con BSA, AGE, FGF-2 ha prodotto un aumento significativo dell’espressione genica di TGF-β e del suo rilascio nell'ambiente extracellulare nelle cellule wt, ma non in quelle HPSE-silenziate (Figura 1). I risultati mostrano inoltre che l'inibizione di HPSE previene l'aumento di espressione e il rilascio di TGF-β nelle cellule tubulari (Figura 2).
I risultati mostrano che dopo 6 ore di trattamento con TGF-β l’espressione di α-SMA, VIM, FN ed MMP-9 risulta significativamente aumentata nelle cellule tubulari wt ma non nelle cellule HPSE-silenziate.
Dopo 24 ore di stimolazione con TGF-β l’espressione dei marcatori mesenchimali nelle cellule wt rimane aumentata. Nelle cellule HPSE-silenziate l’espressione di FN ed MMP-9 risulta aumentata mentre l’espressione di α-SMA e VIM rimane a livelli basali. Dopo 48 ore di trattamento sia nelle cellule wt che HPSE-silenziate l’espressione di α-SMA, VIM, FN e MMP-9 è significativamente aumentata (Figura 3).
L'analisi zimografica mostra che le cellule wt rilasciano MMP-9 già dopo 24 ore di stimolazione con TGF-β mentre le cellule HPSE-silenziate iniziano il rilascio solo dopo 48 ore (Figura 4).
Dopo 48 ore di stimolazione con TGF-β sia le cellule wt che HPSE-silenziate mostrano un fenotipo simil-fibroblastico (Figura 4) ed entrambe rispondono con un aumento di migrazione (Figura 5).
Complessivamente da questo lavoro emerge che la mancanza di eparanasi non impedisce la EMT indotta dal TGF-β ma ne rallenta la comparsa. È stato inoltre dimostrato che l’assenza di eparanasi o la sua inibizione prevengono l’aumento di espressione del TGF-β indotto dagli stimoli pro-fibrotici quali BSA, AGE e FGF-2. L’eparanasi è quindi un elemento chiave nell’espressione del TGF-β in risposta a vari stimoli e nel controllo della sua via di segnalazione.
Queste conclusioni forniscono un’ulteriore dimostrazione che l’eparanasi è implicata nei meccanismi che regolano la EMT delle cellule del tubulo prossimale e, di conseguenza, la fibrosi tubulo-interstiziale.
Data l’incidenza dell’insufficienza renale cronica e la necessità di programmi efficaci di prevenzione e cura, queste considerazioni suggeriscono anche come l’eparanasi possa essere un potenziale e rilevante target farmacologico nel trattamento di nefropatie e della fibrosi renale. La comprensione dei meccanismi molecolari con cui l’eparanasi controlla la EMT nelle cellule del tubulo renale risulta quindi di fondamentale importanza.
[1] Ilan N, Elkin M, Vlodavsky I et al. Regulation, function and clinical significance of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis. The international journal of biochemistry & cell biology 2006;38(12):2018-39
[2] 18. Masola V, Gambaro G, Tibaldi E, Brunati AM, Gastaldello A, D'Angelo A, Onisto M, Lupo A. Heparanase and syndecan-1 interplay orchestrates fibroblast growth factor-2-induced epithelial-mesenchymal transition in renal tubular cells. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2):1478-88
[3] Gil N, Goldberg R, Neuman T, Garsen M, Zcharia E, Rubinstein AM, van Kuppevelt T, Meirovitz A, Pisano C, Li JP, van der Vlag J, Vlodavsky I, Elkin M. Heparanase is essential for the development of diabetic nephropathy in mice. Diabetes. 2012 Jan;61(1):208-16.
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